周 軍 金福源

1.蘇州市動(dòng)物園，江蘇蘇州215000；2.江蘇省蘇州市吳江區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇蘇州215200

病理組織觀察是研究動(dòng)物疾病的病因、發(fā)病機(jī)理和患病機(jī)體內(nèi)所呈現(xiàn)的代謝、機(jī)能和形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而來(lái)闡明疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，為疾病的診斷和防治提供理論基礎(chǔ)和診斷依據(jù)[1]。病理組織觀察即將病變組織制成切片，染色后經(jīng)光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織和細(xì)胞病理變化的觀察。肝臟是幾乎所有脊椎動(dòng)物消化系統(tǒng)中最大的消化腺，是機(jī)體新陳代謝的重要器官。動(dòng)物機(jī)體發(fā)生傳染病、自身免疫性疾病或消化、代謝類(lèi)疾病，其肝臟組織一般會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化[2]。肝臟組織是由肝小葉和肝腺泡組成，肝小葉以中央靜脈為中心，匯管區(qū)為邊緣的六邊形結(jié)構(gòu)，而肝腺泡中心為匯管區(qū)。病理學(xué)常把肝損傷分為7種經(jīng)典類(lèi)型，即：纖維化和肝占位、小葉性損傷、脂肪變性、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)膽管反應(yīng)、未見(jiàn)明顯異常，往往病變類(lèi)型對(duì)應(yīng)不同的病因。然而也有研究證明，肝臟組織病變是牽連性的，即多種類(lèi)型的疾病或其他器官的疾病均可累及肝臟。本研究通過(guò)原收集、固定的肝臟組織，通過(guò)組織病理學(xué)觀察，對(duì)不同種屬的圈養(yǎng)野生動(dòng)物的肝臟組織病理變化進(jìn)行分類(lèi)，并對(duì)常見(jiàn)病變類(lèi)型進(jìn)行分析和總結(jié)，進(jìn)而摸索圈養(yǎng)野生動(dòng)物肝臟組織病理變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究選取85例本動(dòng)物園保存的福爾馬林溶液固定的肝臟組織，其中包括35例草食動(dòng)物、13例雜食動(dòng)物、18例肉食類(lèi)動(dòng)物、19例鳥(niǎo)類(lèi)動(dòng)物。

1.2 切片制作和染色

取出固定肝組織，用清水沖洗4 h，經(jīng)50%酒精脫水12 h后依次經(jīng)70%、85%、90%、100%酒精脫水，然后將肝臟組織塊放入3∶1 酒精+二甲苯混合液、2∶1 酒精+二甲苯混合液、1∶1 酒精+二甲苯混合液30 min，再放入二甲苯，2次各30 min。將恒溫箱調(diào)至57℃并保持恒定，將肝組織依次浸入二甲苯+石蠟混合溶液（3∶1）、二甲苯+石蠟混合溶液（2∶1）、二甲苯+石蠟混合溶液（1∶1）、石蠟溶液各1 h。最后進(jìn)行包埋、切片，切片厚度約為5 mm，石蠟切片經(jīng)脫蠟復(fù)水后進(jìn)入染色步驟[3]。

染色采用經(jīng)典的蘇木精-伊紅染色法（H.E.染色），基本步驟如下：切片放入蘇木精中染色約8 min，用自來(lái)水流水沖洗3～5 min后，將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色15 s。伊紅染液染色15 min后用85%酒精清洗，再次經(jīng)歷脫水步驟后，用中性樹(shù)膠封存。

1.3 數(shù)據(jù)整理和分析

用光學(xué)顯微鏡對(duì)制作好的肝臟組織切片進(jìn)行觀察，將觀察結(jié)果錄入Excel 2016，統(tǒng)計(jì)相應(yīng)的病變類(lèi)型及比例，進(jìn)行相應(yīng)的描述性分析。

2 結(jié)果與分析

85例圈養(yǎng)野生動(dòng)物肝組織石蠟切片中共出現(xiàn)9種病變類(lèi)型，分別為肝細(xì)胞變性、肝小葉排列紊亂、中央靜脈淤血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肝竇水腫、肝竇充血、出血、纖維組織增生、血黃素沉著，其中肝細(xì)胞變性（83.53%，71/85）、肝小葉排列紊亂（70.59%，60/85）、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（65.88%，56/85）為主要病變類(lèi)型。雜食、肉食和鳥(niǎo)類(lèi)動(dòng)物中肝細(xì)胞變性、肝小葉排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均排在各類(lèi)型動(dòng)物肝組織病變中的前3位。食草動(dòng)物中央靜脈淤血達(dá)25例，檢出率為71.43%（25/35），位于肝小葉排列紊亂（30，85.71%）和肝細(xì)胞變性（28，80.00%）。在食草動(dòng)物中，還發(fā)現(xiàn)肝竇水腫（5例）、充血（10例）、出血（6例）、纖維組織增生（4例）和血黃素沉著（3例）。此外，雜食動(dòng)物組織切片還觀察到肝竇充血6例，無(wú)其他病變類(lèi)型。肉食動(dòng)物無(wú)肝竇水腫和含鐵血黃素沉著類(lèi)型，鳥(niǎo)類(lèi)動(dòng)物無(wú)肝竇水腫、出血，纖維組織增生和含鐵血黃素沉著等類(lèi)型（表1）。

4種類(lèi)型圈養(yǎng)野生動(dòng)物肝組織切片病變類(lèi)型多種，且隨著病變數(shù)量增多，其切片數(shù)量下降。1種病變類(lèi)型檢出率為95.29%，食草圈養(yǎng)野生動(dòng)物檢出率最高為100%，其次為鳥(niǎo)類(lèi)動(dòng)物。2種病變類(lèi)型檢出率為64.71%，其中雜食類(lèi)動(dòng)物檢出率最高（84.62%），鳥(niǎo)類(lèi)檢出率最低（36.84%）。3種病變類(lèi)型檢出率為31.76%，雜食類(lèi)檢出率最高，其次是食草動(dòng)物。4種及以上僅食草類(lèi)動(dòng)物和雜食動(dòng)物的肝組織切片存在，其余2類(lèi)型動(dòng)物不存在4種及以上病變類(lèi)型（表2）。

3 討 論

H.E.染色鏡檢是目前最為常用的組織病理切片制作方法，本次研究通過(guò)該方法發(fā)現(xiàn)圈養(yǎng)野生動(dòng)物病變中以肝細(xì)胞變性、肝小葉排列紊亂和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主，且部分組織切片具有2種及2種以上病變類(lèi)型，但其數(shù)量較1種病變類(lèi)型較低。除該3種較多的病變類(lèi)型中，還伴隨諸如中央靜脈淤血、肝竇充血、出血等病變類(lèi)型。食草和肉食動(dòng)物肝組織病變類(lèi)型最多，而雜食動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)動(dòng)物病變類(lèi)型相對(duì)較少。此外，食草動(dòng)物肝組織中央靜脈淤血比例顯著高于其他3種類(lèi)型動(dòng)物。肉食動(dòng)物的肝竇充血、出血的比例顯著高于其他類(lèi)型動(dòng)物。3種主要病變類(lèi)型，包括肝細(xì)胞變性、肝小葉排列紊亂和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)檢出比例相差不大。

病理組織鏡檢要求鏡檢人員具有豐富的病理基礎(chǔ)知識(shí)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)[4]，不同的獸醫(yī)觀察人員針對(duì)同樣的病理組織切片可能會(huì)得出不同的觀察結(jié)果，尤其是病變類(lèi)型較多的切片。本次研究為避免此現(xiàn)象的出現(xiàn)，初步采用1名觀察人員進(jìn)行判定，但在后期的研究中可采用1名或多名獸醫(yī)進(jìn)行觀察，并采用一致性分析對(duì)結(jié)果做出研判。隨著飼養(yǎng)條件的改善，傳染性疾病在圈養(yǎng)野生動(dòng)物中發(fā)生的比例逐步下降，但應(yīng)激性、免疫性等非傳染性疾病和養(yǎng)殖過(guò)程中不明原因的致病因素呈上升趨勢(shì)，再對(duì)癥狀觀察得不到確切診斷結(jié)論時(shí)，組織病理觀察可為診斷疾病提供重要的輔助，尤其對(duì)于因肝臟病變?nèi)缰靖?、中毒性肝炎等可提供非常重要的依?jù)。

表1 圈養(yǎng)野生動(dòng)物肝組織病變類(lèi)型 例

表2 圈養(yǎng)野生動(dòng)物肝組織病變數(shù)量

此外，影響切片的制作也會(huì)影響觀察效果，石蠟切片制作時(shí)間較長(zhǎng)，制作工藝也相對(duì)復(fù)雜，其中幾個(gè)步驟較為關(guān)鍵，如脫水、切片、透明、染色等[5]。因此，在制作石蠟切片的過(guò)程中需要標(biāo)準(zhǔn)化程序，且選擇制作經(jīng)驗(yàn)較為豐富的人員進(jìn)行質(zhì)量控制。此外，石蠟切片相對(duì)制作較為簡(jiǎn)單的冰凍切片可長(zhǎng)期保存，具有復(fù)檢復(fù)核的優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)本園保存的85例肝臟組織進(jìn)行石蠟切片制作和觀察發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞變性、肝小葉排列紊亂和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為收集肝臟組織中最主要的病變類(lèi)型。肝細(xì)胞變性常見(jiàn)于缺氧、缺血、中毒、感染等系列疾病，肝小葉排列紊亂可見(jiàn)于肝硬化的早期，而炎性細(xì)胞浸潤(rùn)可出現(xiàn)在多種情況下，以肝炎為主。在獸醫(yī)臨床實(shí)踐中，尤其是動(dòng)物園中圈養(yǎng)野生動(dòng)物疾病的實(shí)踐中，除觀察相應(yīng)的癥狀外，可結(jié)合相應(yīng)的病理組織切片觀察，總結(jié)多種疾病造成肝組織切片病變類(lèi)型，從而對(duì)疾病做出準(zhǔn)確診斷并進(jìn)行疾病防治，尤其是對(duì)較為珍貴的野生動(dòng)物具有較大的經(jīng)濟(jì)和實(shí)踐價(jià)值。