葉學(xué)敏，董丹琪，邵 華，曹小吉，莫衛(wèi)民

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 分析測(cè)試中心，浙江 杭州 310014；2.浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

磺胺類藥物(SAs)是一類具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的人工合成藥物，作為廣譜抗菌劑被廣泛用于獸醫(yī)臨床和家畜養(yǎng)殖。然而，磺胺類藥物可在生物體內(nèi)殘留，并以母體及代謝產(chǎn)物的形式通過尿液和糞便排泄進(jìn)入環(huán)境中造成一定的污染。近年來，我國(guó)的珠江、海河、長(zhǎng)江、太湖、巢湖等流域水體均發(fā)現(xiàn)不同程度的磺胺類抗生素污染[1]，盡管SAs含量不高，但由于其在環(huán)境中不易發(fā)生降解，會(huì)長(zhǎng)期存在并累積，因此會(huì)對(duì)水體中生態(tài)系統(tǒng)平衡構(gòu)成威脅，擾亂水中生物鏈，若存在抗生素的生活飲用水長(zhǎng)期被人類所飲用，會(huì)對(duì)人群健康產(chǎn)生危害風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。因此，有必要建立水體中磺胺類藥物的檢測(cè)方法，通過了解水體的污染狀況，及時(shí)采取有效的措施進(jìn)行控制，從而減少環(huán)境污染和降低對(duì)生態(tài)的破壞程度。

由于環(huán)境水體中磺胺類藥物含量極低，且基質(zhì)復(fù)雜，在檢測(cè)前需要對(duì)其進(jìn)行分離富集。目前環(huán)境水樣中磺胺類藥物的凈化富集技術(shù)主要有固相萃取[4-7]、磁性固相萃取[8-10]等。磁性固相萃取技術(shù)在一定程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)固相萃取技術(shù)的不足，具有有機(jī)試劑消耗少、前處理步驟簡(jiǎn)單、待測(cè)物質(zhì)回收率較高、精密度較好且樣品不易損失等優(yōu)點(diǎn)[11]。磁性混合半膠束固相萃取技術(shù)是基于磁性固相萃取的新型固相萃取方法，它借助靜電作用力、疏水作用力等相互作用力，將十二烷基磺酸鈉(SDS)[9,12]、十六烷基三甲基溴化銨(Cetyltrimethylammonium bromide，CTAB)[13]或離子液體(Ionic liquid，IL)[14-16]等離子型表面活性劑吸附到磁性金屬氧化物或二氧化硅表面，形成半膠束和全膠束的混合物，并以該混合物作為吸附劑，對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行富集、凈化和濃縮的技術(shù)，對(duì)有機(jī)污染物萃取能力強(qiáng)，且僅需幾毫升有機(jī)溶劑即可完全洗脫，具有分析物范圍廣、易洗脫、萃取效率高、操作簡(jiǎn)便、綠色環(huán)保、低成本等優(yōu)點(diǎn)[14,17]，在富集萃取不同極性的分析物方面顯示出廣泛的應(yīng)用前景。本研究旨在通過構(gòu)建磁性離子液體混合半膠束體系，建立水中痕量磺胺類藥物的離子液體混合半膠束磁性固相萃取-液相色譜檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和試劑

磺胺噻唑(Sulfathiazole，STZ)、磺胺甲二唑(Sulfamethizole，SMTZ)、磺胺苯甲酰(Sulfabenzamide，SBA)、磺胺氯吡嗪(Sulfaclozine，SCZ)，4 種磺胺類藥物的結(jié)構(gòu)信息見表1，純度均大于98.0%，購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司；由甲醇配制為5 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-4 ℃避光保存，根據(jù)需要再用甲醇逐級(jí)稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。甲醇、乙腈為色譜純?cè)噭?，?gòu)自Merck公司(Darmstadt，德國(guó))。超純水由Milli-Q水純化系統(tǒng)(18 MΩ，Millipore，Bedford，MA，USA)制備。

表1 4 種磺胺類藥物的結(jié)構(gòu)信息Table 1 Structures of four sulfanilamides compounds

離子液體[C14mim][BF4]購(gòu)自上海成捷化學(xué)有限公司。用于合成磁性二氧化硅(Fe3O4@SiO2)的(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O、(NH4)Fe(SO4)2·12H2O、25%氨水和正硅酸乙酯(TEOS)均為分析純，購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司。N50級(jí)的鐵釹硼強(qiáng)磁鐵(50 mm×50 mm×10 mm)購(gòu)自鄞州冠能磁業(yè)有限公司(寧波，中國(guó))。

1.2 Fe3O4@SiO2的合成與表征

根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法制備Fe3O4@SiO2。首先采用化學(xué)共沉淀法制備Fe3O4磁核，其次采用Stober法在Fe3O4磁核外包裹上SiO2，然后用磁鐵將Fe3O4@SiO2從懸浮液中分離出來，分別用超純水和無水乙醇洗滌3 次，50 ℃真空干燥5 h。

Fe3O4@SiO2的結(jié)構(gòu)經(jīng)過紅外光譜(Nicolet 6700，Thermo，USA)、X’Pert PRO型X射線衍射儀(PANalytical，Netherlands)確證，并采用S-4700掃描電子顯微鏡(Hitach，Japan)分析形貌，采用振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(Lake shore 7410，USA)表征磁場(chǎng)強(qiáng)度。通過測(cè)量在不同pH條件下Fe3O4@SiO2懸浮液的Zeta-電位(DelsaTM Nano C，Beckman Coulter，USA)來表征Fe3O4@SiO2納米顆粒的表面帶電狀態(tài)。

1.3 磁性固相萃取過程

10 mL水樣中加入5 mg Fe3O4@SiO2和C14mimBF4，使C14mimBF4的最終質(zhì)量濃度為300 μg/mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為10，然后將此懸濁液超聲20 min分散，靜置10 min。然后將N50的NdFeB磁鐵靜置于瓶壁外一段時(shí)間，當(dāng)懸浮液變得清澈時(shí)(約1 min后)，棄去上清液，并用4 mL(每次2 mL)1%的甲酸乙腈溶液在超聲作用下對(duì)吸附了磺胺類化合物的吸附劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，在40 ℃下用氮?dú)獯蹈?，并? mL含5%的乙腈水溶液溶解后過0.22 μm尼龍濾膜，注入U(xiǎn)PLC系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.4 磺胺類藥物的UPLC檢測(cè)方法

磺胺類藥物采用Waters Acquity超高效液相色譜儀檢測(cè)，色譜柱型號(hào)為CSHTMC18(100 mm× 2.1 mm，1.7 μm)。流動(dòng)相線性梯度洗脫條件見表2，其中流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。流速0.4 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。洗脫液經(jīng)過色譜柱后直接進(jìn)入PDA檢測(cè)器。

表2 磺胺的高效液相色譜洗脫梯度條件

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4@SiO2納米顆粒的合成與表征

圖1(a)為Fe3O4@SiO2的紅外光譜圖，圖中588.9 cm-1的峰對(duì)應(yīng)磁核的Fe—O—Fe伸縮振動(dòng)，1 088.9 cm-1的峰對(duì)應(yīng)Si—O—Si基團(tuán)的面內(nèi)伸縮振動(dòng)，1 634.5，3 435.0 cm-1分別對(duì)應(yīng)Si—OH的彎曲振動(dòng)和伸縮振動(dòng)。圖1(b)為Fe3O4@SiO2的X-射線衍射圖，圖中2θ=30.2°，35.6°，43.3°，53.6°，57.2°，62.8°處的衍射峰分別對(duì)應(yīng)純立方尖晶石晶系Fe3O4的220，311，400，422，511和440晶面(JCPDS卡，03-065-3107)的特征吸收峰，而無定型SiO2在XRD圖中則不顯示。圖1(a, b)的結(jié)果表明Fe3O4@SiO2納米顆粒已經(jīng)成功制備。圖1(c)為Fe3O4@SiO2的掃描電鏡圖，從圖中可以看出，制備的Fe3O4@SiO2納米顆粒外觀近似呈球形，直徑為50～70 nm。如圖1(d)所示，F(xiàn)e3O4@SiO2沒有磁滯現(xiàn)象，表現(xiàn)出了良好的超順磁性特征，其最大飽和磁化強(qiáng)度為37.0 emu/g，說明該材料在外加磁場(chǎng)的作用下很容易被分離出來。圖1(e)為不同pH條件下Fe3O4@SiO2懸浮液的Zeta電位，由圖可知Fe3O4@SiO2納米顆粒的等電點(diǎn)為3.2，與文獻(xiàn)報(bào)道的二氧化硅的等電點(diǎn)為3.0的結(jié)果[19]基本一致。當(dāng)pH高于3.2時(shí)，F(xiàn)e3O4@SiO2納米顆粒表面帶負(fù)電荷，可以與離子液體的陽離子部分產(chǎn)生靜電吸附作用。而當(dāng)pH高于8時(shí)，體系的zeta電位基本維持在-32 mV，說明pH大于8是Fe3O4@SiO2納米顆粒呈負(fù)電最穩(wěn)定的區(qū)域，能吸附離子液體的陽離子部分形成穩(wěn)定的磁性混合半膠束體系。

圖1 Fe3O4@SiO2的表征結(jié)果Fig.1 Characterization of Fe3O4@SiO2 nanoparticles

2.2 Fe3O4@SiO2@C14mimBF4混合半膠束體系的構(gòu)建

為了構(gòu)建Fe3O4@SiO2@C14mimBF4混合半膠束體系，考察了離子液體C14mimBF4在Fe3O4@SiO2納米顆粒表面的吸附情況。圖2為pH值為10時(shí)C14mimBF4質(zhì)量濃度對(duì)體系Zeta電位的影響。由圖2可知：當(dāng)C14mimBF4的質(zhì)量濃度為0～45 μg/mL時(shí)，Zeta電位從負(fù)值增加至零。此時(shí)，由于靜電吸引力的作用，[C14mim]+陽離子逐漸被吸附在帶負(fù)電荷的Fe3O4@SiO2納米顆粒表面，直至正負(fù)電荷完全抵消，形成Fe3O4@SiO2納米顆粒表面單層吸附滿C14mimBF4的半膠束(hemimicelles)體系；當(dāng)C14mimBF4質(zhì)量濃度為45～300 μg/mL時(shí)，Zeta電位由零逐漸增大到最大值。此時(shí)，由于疏水作用和靜電排斥力的共同作用，C14mimBF4的長(zhǎng)鏈烷基尾端朝內(nèi)，極性咪唑環(huán)朝外，吸附在半膠束的外層，由于此時(shí)體系中單層半膠束和雙層膠束共同存在，因此該區(qū)域稱為混合半膠束(mixed hemimicelles)區(qū)域，混合半膠束體系的外層既有極性較大的正電咪唑環(huán)，又有極性小的疏水烷基鏈，因此既可以通過靜電作用與極性分析物相互作用，又可以通過疏水作用與疏水性分析物相互作用，為不同類型的分析物提供了兩種不同的保持機(jī)制；當(dāng)C14mimBF4質(zhì)量濃度高于300 μg/mL時(shí)，Zeta電位基本不變，說明雙層吸附達(dá)到飽和，該區(qū)域?yàn)槟z束區(qū)域(admicelles)。由于過量的C14mimBF4也會(huì)在溶液中自聚集形成膠束，吸附部分目標(biāo)分析物，因此會(huì)導(dǎo)致分析物在磁性膠束體系上的吸附量減少，因此該區(qū)域不適合磁性固相萃取。綜上所述，當(dāng)C14mimBF4的質(zhì)量濃度為45～300 μg/mL時(shí)，形成的混合半膠束體系適合作為磁性固相萃取吸附劑。

圖2 C14mimBF4在Fe3O4@SiO2上的Zeta電位等溫線Fig.2 Zeta-potential of Fe3O4@SiO2 nanoparticles by adsorption of C14mimBF4

2.3 C14mimBF4濃度對(duì)磺胺類化合物萃取效率的影響

對(duì)比了pH為10的情況下，不加離子液體C14mimBF4以及C14mimBF4質(zhì)量濃度分別為50，300 μg/mL時(shí)，吸附劑體系對(duì)磺胺類化合物的吸附效果，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)不加離子液體C14mimBF4時(shí)，磺胺類化合物幾乎不吸附在Fe3O4@SiO2納米顆粒的表面；而加入C14mimBF4后，體系對(duì)SAs的吸附率顯著提高，在C14mimBF4質(zhì)量濃度為300 μg/mL時(shí)，吸附率最高。分析原因?yàn)?，在pH值為10時(shí)，F(xiàn)e3O4@SiO2納米顆粒呈負(fù)電荷狀態(tài)，磺胺類化合物由于去質(zhì)子化也呈負(fù)離子的形式(4 種磺胺類化合物的pKa值介于4.83和7.24之間)。當(dāng)不加離子液體時(shí)，SAs和Fe3O4@SiO2之間存在靜電排斥力，導(dǎo)致吸附效率較低；當(dāng)C14mimBF4質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，由Zeta電位等溫線可知此時(shí)C14mimBF4靜電吸附在Fe3O4@SiO2納米顆粒表面使混合半膠束體系帶正電，因此吸附劑對(duì)SAs的靜電排斥力已轉(zhuǎn)變?yōu)殪o電吸引力，因此吸附率增加明顯；當(dāng)C14mimBF4的質(zhì)量濃度達(dá)到300 μg/mL時(shí)，吸附劑對(duì)SAs的靜電吸引力達(dá)到最大值，因此吸附效率也最強(qiáng)。所以最終選定C14mimBF4的質(zhì)量濃度為300 μg/mL。

圖3 C14mimBF4質(zhì)量濃度對(duì)磺胺類化合物萃取效率的影響Fig.3 Effect of the concentration of C14mimBF4 on the extraction of SAs

2.4 Fe3O4@SiO2用量對(duì)磺胺類化合物萃取效率的影響

如圖4所示，考察了不同用量(3，5，10，15 mg)的Fe3O4@SiO2對(duì)水樣中磺胺類化合物吸附率的影響。由圖4可以看出：隨著Fe3O4@SiO2的量從3 mg增加到5 mg，SAs的吸附率也隨之增大；繼續(xù)增大Fe3O4@SiO2用量，SAs回收率基本保持不變。因此，最終選擇5 mg的Fe3O4@SiO2作為最終吸附劑用量。

圖4 Fe3O4@SiO2量對(duì)磺胺類化合物萃取效率的影響Fig.4 Effect of the amount of Fe3O4@SiO2 on the extraction of SAs

2.5 離子強(qiáng)度對(duì)磺胺類化合物萃取效率的影響

通過在水樣中加入不同質(zhì)量濃度的NaCl溶液(10～200 mmol/L)來研究離子強(qiáng)度對(duì)萃取效率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，隨著NaCl質(zhì)量濃度的增加，磺胺類化合物的吸附效率顯著降低。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因有兩種可能：一是溶液中的Na+離子會(huì)與[C14mim]+陽離子競(jìng)爭(zhēng)吸附在Fe3O4@SiO2表面，從而阻礙混合半膠束體系的形成；二是溶液中的Cl-離子會(huì)與去質(zhì)子化的磺胺類負(fù)離子競(jìng)爭(zhēng)吸附在混合半膠束體系的表面，因此吸附磺胺類化合物的量減少。所以最終選定體系中不加鹽。

圖5 離子強(qiáng)度對(duì)磺胺類化合物萃取效率的影響Fig.5 Effect of the ionic strength on the extraction of SAs

2.6 超聲時(shí)間對(duì)磺胺類化合物萃取效率的影響

最佳的萃取時(shí)間既保證了分析物和吸附劑有足夠的相互作用時(shí)間，又最大程度避免了不必要的時(shí)間浪費(fèi)。因此考察了不同超聲時(shí)間(5，10，20，30 min)對(duì)水樣中SAs吸附率的影響。結(jié)果如圖6所示，隨著超聲時(shí)間的增加，SAs的吸附率逐漸增大，當(dāng)萃取時(shí)間為20 min時(shí)，SAs吸附率達(dá)到最大值，而當(dāng)超聲時(shí)間大于20 min時(shí)，SAs吸附率反而有所下降。可能的原因?yàn)檫^長(zhǎng)的超聲時(shí)間會(huì)導(dǎo)致吸附在Fe3O4@SiO2表面的C14minBF4重新脫落下來。因此，最終選擇20 min為最佳的超聲萃取時(shí)間。

圖6 超聲時(shí)間對(duì)磺胺類化合物萃取效率的影響Fig.6 Effect of the ultrasonic time on the extraction of SAs

2.7 方法學(xué)評(píng)價(jià)

在最優(yōu)的萃取條件和色譜條件下，分別對(duì)系列質(zhì)量濃度為10～200 ng/L的磺胺類標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，得到4 種SAs的線性回歸方程，結(jié)果如表3所示。從表3可以看出：4 種SAs的線性相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 1～0.999 9。以3倍信噪比(s/n=3)和10倍信噪比(s/n=10)得到方法的檢出限和定量限分別為1.21～2.25 μg/L和4.23～7.89 μg/L。此外，按每個(gè)水樣平行測(cè)定3 次，每天分4 個(gè)時(shí)段，每個(gè)樣品連續(xù)測(cè)定3 d，最后所得的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.2%～5.3%，日間RSD為3.9%～9.2%。由數(shù)據(jù)可知，此方法重現(xiàn)性和精密度均較為理想、可靠性高。

表3 離子液體混合半膠束磁性固相萃取-超高效液相色譜檢測(cè)方法評(píng)價(jià)Table 3 Evaluation of the ionic liquid mixed hemimicelles magnetic solid-phase extraction-UPLC method

2.8 實(shí)際水樣的測(cè)定

采用所建立的混合半膠束固相萃取-UPLC檢測(cè)方法分別對(duì)杭州市上塘河、西湖和錢塘江的水樣進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，4 種磺胺類藥物的加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為10 μg/L和20 μg/L，每個(gè)濃度平行檢測(cè)3 組，空白樣品為對(duì)照，空白樣品和加標(biāo)水樣中4 種磺胺類藥物的液相色譜圖見圖7，其平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表4。結(jié)果表明，在杭州市的3 處水樣中均未檢出磺胺類藥物殘留。STZ、SMTZ、SBA和SCZ的回收率為70%～100%，4 種磺胺類化合物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。說明該方法精確度高、重現(xiàn)性好，適用于實(shí)際水樣中STZ、SMTZ、SBA和SCZ這4 種磺胺類化合物的檢測(cè)。

圖7 空白樣品和加標(biāo)水樣中4 種磺胺類藥物的液相色譜圖Fig.7 LC chromatograms of 4 SAs in blank and spiked water samples

表4 水樣中4 種磺胺類化合物的加標(biāo)回收率Table 4 Recovery of sulfonamides in water samples

3 結(jié) 論

本研究首先制備了具有良好磁性的Fe3O4@SiO2吸附劑，通過考察離子液體在Fe3O4@SiO2表面的Zeta電位，成功構(gòu)建了基于C14mimBF4離子液體的混合半膠束磁性固相萃取體系，并將其應(yīng)用于環(huán)境水樣中的磺胺類藥物的磁性混合半膠束固相萃取檢測(cè)。對(duì)影響萃取效率的主要因素，包括C14mimBF4離子液體濃度、Fe3O4@SiO2量、離子強(qiáng)度、超聲萃取時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行了探索與優(yōu)化，建立了適合磺胺類化合物分析的磁性混合半膠束固相萃取-超高效液相色譜檢測(cè)方法。與傳統(tǒng)的固相萃取方法相比，所建立的方法具有綠色環(huán)保(有機(jī)溶劑用量少，磁性材料用量少并可重復(fù)利用)、簡(jiǎn)便快速(磁性分離操作簡(jiǎn)便、分離速度快，避免繁瑣的過柱程序)、分析物易洗脫等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)果表明，本研究制備的Fe3O4@ SiO2@ C14mimBF4萃取劑能夠有效地用于環(huán)境水樣中痕量磺胺類藥物的吸附萃取。