陶 益，江恩賜，姜慧潔，顏繼忠，蔡寶昌

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

斑馬魚是一種脊椎動(dòng)物模型，在生物學(xué)方面，斑馬魚和人具有很多共同點(diǎn)，譬如斑馬魚和人共有82%藥物靶點(diǎn)，具有相似的藥物代謝酶譜[1]，目前斑馬魚已經(jīng)成功地應(yīng)用于藥物篩選、靶標(biāo)鑒定、藥理學(xué)和毒理學(xué)等方面的研究[2-4]。但是，關(guān)于斑馬魚疾病模型在中藥活性成分評(píng)價(jià)方面的報(bào)道仍然較少，韋英杰課題組首次提出了基于斑馬魚模型的中藥代謝研究思路與方法，建立一種能體現(xiàn)中藥作用整體觀的模式生物的中藥代謝研究新平臺(tái)，并應(yīng)用于川續(xù)斷[5]、淫羊藿[6]、強(qiáng)骨膠囊[7]中抗骨質(zhì)疏松活性成分的篩選和活性成分川續(xù)斷皂苷VI、淫羊藿苷A等的代謝研究，均取得了良好的預(yù)期效果。

牛膝是常規(guī)大宗藥材之一，有生牛膝和鹽牛膝等炮制品種，現(xiàn)代研究報(bào)道其具有抗骨質(zhì)疏松癥作用[8-9]。傳統(tǒng)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松評(píng)價(jià)模型成模周期長(zhǎng)(1 個(gè)月)、成本高、效率低，而斑馬魚骨質(zhì)疏松評(píng)價(jià)模型成?？?10 d)、成本低、效率高。大量研究證實(shí)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)通路能調(diào)控骨形成與骨吸收的平衡，而Smad蛋白家族直接介導(dǎo)TGF-β通路下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在調(diào)節(jié)骨代謝過程中扮演重要的角色[10]。本研究探索建立斑馬魚骨質(zhì)疏松模式生物模型，用于牛膝生品和鹽炙品的抗骨質(zhì)疏松活性評(píng)價(jià)，同時(shí)對(duì)骨質(zhì)疏松斑馬魚中TGF-β/Smad信號(hào)通路蛋白水平進(jìn)行Western Blot分析，為牛膝不同炮制品的抗骨質(zhì)疏松癥機(jī)理研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 斑馬魚

AB品系斑馬魚購(gòu)自于南京堯順禹生物科技有限公司。

1.1.2 試 劑

潑尼松龍、MS-222、二甲基亞砜(DMSO)、多聚甲醛和茜素紅S購(gòu)自上海阿拉丁生化科技有限公司；牛膝藥材在河南溫縣收集，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)蔡寶昌教授鑒定為莧科植物牛膝Achyranthesbidentata的干燥根，批號(hào)20151228；鹽購(gòu)自江蘇省鹽業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司；一抗包括兔抗TGF-β1(1∶4 000，ab92486)，兔抗p-smad 2/3(1∶500，ab63399)，兔抗Smad 4(1∶4 000，ab40759)，兔抗Smad 7(1∶500，ab216428)和小鼠單克隆GAPDH抗體(1∶1 000)購(gòu)自Abcam；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 000，BA1056)或山羊抗小鼠IgG(1∶2 000，BA1101)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3 儀 器

ZEISS宏觀變倍顯微鏡(ZEISS，型號(hào)：Axio Zoom V16)，天能全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(上海天能，型號(hào)：Tanon-5200)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

培養(yǎng)基包含5 mmol/L NaCl、0.17 mmol/L KCl、0.33 mmol/L CaCl2和0.33 mmol/L MgSO4。

1.2.2 潑尼松龍儲(chǔ)備液和工作液的配制

精密稱取潑尼松龍90.6 mg，加入DMSO 20 mL，用培養(yǎng)基定容至100 mL，終濃度為2 500 μmol/L，作為儲(chǔ)備液。配制工作液時(shí)，取1 mL潑尼松龍儲(chǔ)備液，加入6 mL DMSO后，用培養(yǎng)基定容至100 mL，終濃度為25 μmol/L。

1.2.3 牛膝的炮制

稱取2 g鹽加5倍量水溶解，取牛膝段100 g，置容器內(nèi)，加入鹽水拌勻，密閉悶潤(rùn)2 h，將炒鍋預(yù)熱，倒入鹽水悶潤(rùn)的牛膝，用文火炒至顏色變深，微帶焦斑，取出，晾涼，得到鹽牛膝備用。

1.2.4 生、鹽牛膝干燥粉末的制備

稱取生牛膝或鹽牛膝20 g，轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，加入160 mL水，放入電熱套中加熱回流提取2 h，重復(fù)兩次，合并提取液，減壓冷凍干燥，得粉末備用。

1.2.5 生、鹽牛膝儲(chǔ)備液和工作液的配制

精密稱取生、鹽牛膝水提物干燥粉末50 mg，加入DMSO 10 mL，用培養(yǎng)基定容至50 mL，最終質(zhì)量濃度為1 g/L，作為生、鹽牛膝儲(chǔ)備液。量取20 mL 生、鹽牛膝儲(chǔ)備液，加入1 mL 2 500 μmol/L潑尼松龍溶液，再加入6 mL DMSO，用培養(yǎng)基定容至100 mL，作為生、鹽牛膝工作液。

1.2.6 斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的構(gòu)建與生牛膝、鹽牛膝防治功能的初步分析

將受精后第5天(5 dpf)的斑馬魚幼魚分成4 組，置 6 孔板中，每組3 孔，每孔10 條幼魚。其中一組給予0.5% DMSO，作為陰性對(duì)照，其余3 組給予25 μmol/L潑尼松龍模型藥，置于恒溫培養(yǎng)箱中28.5 ℃培養(yǎng)。48 h后，將其中一組的模型藥替換為含25 μmol/L潑尼松龍的200 mg/L鹽牛膝溶液，另一組的模型藥替換為含25 μmol/L潑尼松龍的200 mg/L生牛膝溶液，每天換藥，培養(yǎng)至第10天(10 dpf)，將各組斑馬魚取出進(jìn)行固定和茜素紅染色并進(jìn)行骨礦化量分析。

1.2.7 斑馬魚幼魚的固定、骨骼染色與分析方法

將斑馬魚幼魚培養(yǎng)至10 dpf，用4%多聚甲醛4 ℃固定過夜后，使用含3% H2O2的0.5% KOH將魚體漂白40 min，然后采用溶于70%乙醇的0.01%茜素紅溶液對(duì)斑馬魚幼魚染色24 h，第2天用1% KOH脫色3 min，最后用梯度比分別為3∶1，1∶1，1∶3的1% KOH和甘油的混合溶液依次浸泡幼魚，將幼魚透明化。最后將幼魚保存于純甘油中。使用顯微鏡拍攝幼魚頭部腹面照。然后采用圖像分析軟件將幼魚頭部骨骼染色面積和累積光密度進(jìn)行分析計(jì)算，以反映骨礦化量。

1.2.8 TGF-β/Smad信號(hào)通路中標(biāo)志性蛋白水平變化

用PBS(pH 7.4)洗滌各組斑馬魚幼魚兩次，然后在冰冷的蛋白質(zhì)裂解緩沖液中勻漿以提取蛋白質(zhì)。勻漿在4 ℃下以12 000g離心15 min后，收獲上清液，通過BCA蛋白試劑盒定量蛋白質(zhì)的濃度。將蛋白質(zhì)與上樣緩沖液混合，在95 ℃下煮沸6 min使其變性。分離出40 μg總蛋白質(zhì)通過5%和10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到0.45 μm聚偏二氟乙烯膜中。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h后，將膜與一抗孵育：兔抗-TGF-β1(1∶4 000)，兔抗-p-smad 2/3(1∶500)，兔抗Smad 4(1∶4 000)，兔抗Smad 7(1∶500)和小鼠單克隆GAPDH抗體(1∶1 000)分別在4 ℃過夜。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶10 000)或山羊抗小鼠IgG(1∶20 000)作為第二抗體檢測(cè)膜1 h。通過電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑使蛋白質(zhì)條帶可視化。GAPDH用于標(biāo)準(zhǔn)化處理，通過Image J軟件進(jìn)行分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 不同組別斑馬魚頭骨發(fā)育狀況分析

受精后10 d的斑馬魚不同組別的腹面頭骨茜素紅染色顯微成像如圖1所示，可見鈣化的骨礦化基質(zhì)部位被染成了紅色。與DMSO對(duì)照組，潑尼松龍?jiān)炷＝M茜素紅染色面積顯著減少。與潑尼松龍模型組相比，生、鹽牛膝組染色面積有不同程度的增多，且鹽牛膝組斑馬魚染色面積增加程度高于生牛膝組。

圖1 不同組別斑馬魚茜素紅染色的顯微成像圖Fig.1 Microscopic image of zebrafish after alizarin red staining in different groups

2.2 斑馬魚幼魚頭骨茜素紅染色面積與累計(jì)光密度分析

如圖2，3所示，與DMSO對(duì)照組相比，潑尼松龍組斑馬魚頭骨礦化面積和累積光密度值，呈顯著性差異(P<0.05)，這提示潑尼松龍成功誘導(dǎo)斑馬魚骨質(zhì)疏松模型。生、鹽牛膝給藥組的斑馬魚頭骨礦化面積和累積光密度值較模型組均有顯著提高(P<0.05)，說明生、鹽牛膝可部分阻止?jié)娔崴升堈T導(dǎo)的斑馬魚骨丟失，而且鹽牛膝的作用強(qiáng)于生牛膝。

圖2 不同組別斑馬魚頭骨礦化面積Fig.2 Mineralized areas of zebrafish skull in different groups

圖3 不同組別斑馬魚累積光密度分析Fig.3 Cumulative optical density analysis of zebrafish skull in different groups

2.3 不同組斑馬魚中TGF-β/Smad信號(hào)通路中標(biāo)志性蛋白水平

如圖4, 5所示，與空白組相比，模型組斑馬魚的TGF-β1，p-Smad 2/3和Smad 4蛋白水平顯著降低(P<0.05)，Smad 7蛋白水平顯著上升(P<0.05)，這說明模型組斑馬魚的TGF-β/Smad信號(hào)通路受到潑尼松龍的抑制。和模型組相比，生、鹽牛膝給藥組的TGF-β1，p-Smad 2/3和Smad 4蛋白水平顯著提高(P<0.05)，接近甚至超過正常組，而Smad 7蛋白水平顯著下降(P<0.05)，但仍然高于正常組的水平，這說明生、鹽牛膝給藥組能夠逆轉(zhuǎn)模型組TGF-β/Smad信號(hào)通路的抑制作用。此外，鹽牛膝組TGF-β1，p-Smad 2/3，Smad 4和Smad 7蛋白水平的變化幅度大于生牛膝組，兩組有顯著性差異(P<0.05)，這提示鹽牛膝能夠更有效地逆轉(zhuǎn)潑尼松龍對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的抑制作用，更好地促進(jìn)骨骼的發(fā)育生長(zhǎng)。

圖4 不同組別斑馬魚中TGF-β1, p-Smad 2/3, Smad 4 和 Smad 7 蛋白條帶Fig.4 Protein bands of TGF-β1, p-Smad 2/3, Smad 4 and Smad 7 of different groups

圖5 不同組別斑馬魚中TGF-β1, p-Smad 2/3, Smad 4 和 Smad 7蛋白表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of TGF-β1, p-Smad 2/3, Smad 4 and Smad 7 in different groups of zebrafish

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)主要研究生、鹽牛膝提取物對(duì)斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的治療作用，并探討其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：生、鹽牛膝提取物均能顯著改善斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的頭骨礦化面積和累積光密度，鹽牛膝的改善幅度大于生牛膝提取物。同時(shí)Western Blot分析發(fā)現(xiàn)：生、鹽牛膝提取物均能顯著上調(diào)TGF-β1，p-Smad 2/3及Smad 4蛋白表達(dá)水平，下調(diào)Smad 7蛋白表達(dá)水平，鹽牛膝的調(diào)控力度大于生牛膝。綜上所示，生、鹽牛膝提取物均有治療骨質(zhì)疏松癥的作用，可能與調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)，此外，鹽牛膝的治療作用優(yōu)于生牛膝，這也提示中藥炮制具有增效作用。