胡韻卓, 石媛媛, 黃小芳a,, 畢楚韻a,, 周麗香, 梁才曉, 黃碧芳,許明, 林世強(qiáng)a,*, 陳選陽(yáng)a,*

(福建農(nóng)林大學(xué), a. 作物生物技術(shù)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b. 植物保護(hù)學(xué)院；c. 農(nóng)學(xué)院；d. 生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002)

Flor提出“基因?qū)颉奔僬f(shuō)，認(rèn)為對(duì)于病原的每個(gè)無(wú)毒基因(Avr)，宿主都有1個(gè)相應(yīng)的抗性基因(R基因)，這2個(gè)基因產(chǎn)物互作激活宿主的防御反應(yīng), 如超敏反應(yīng)(hypersensitive response, HR)[1]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域基序，R基因的編碼產(chǎn)物R蛋白分為5類[2],第一類含有絲氨酸-蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和十四烷基化結(jié)構(gòu)域；第二類包含LRR (leucine-rich repeat)結(jié)構(gòu)域、NBS (nucleotide-binding site)結(jié)構(gòu)域和位于N端的亮氨酸拉鏈(leucine zipper)或卷曲螺旋(coiled coil)序列；第三類和第二類相似，但N端序列為T(mén)IR(toll and Interleukin 1 receptor)結(jié)構(gòu)域；第四類具有跨膜結(jié)構(gòu)域和胞外LRR結(jié)構(gòu)域，但是缺失NBS; 第五類含有跨膜結(jié)構(gòu)域、胞外LRR結(jié)構(gòu)域和絲氨酸-蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。在這些結(jié)構(gòu)域中，NBS結(jié)構(gòu)域是這類蛋白家族的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，可能通過(guò)與核苷酸結(jié)合或水解來(lái)影響R蛋白的功能。

三裂葉薯(Ipomoea triloba)是栽培甘薯(I.batatas)的二倍體近緣野生種，主要分布于我國(guó)臺(tái)灣、廣東和美洲熱帶等地，具有抗旱、抗病等優(yōu)良性狀[3-4]。研究表明[5-6]，野生種三裂葉薯可作為克服種間雜交不親和性，通過(guò)胚胎培養(yǎng)獲得雜種的重要材料。三裂葉薯基因組測(cè)序于2018年完成[7]，本研究基于測(cè)序結(jié)果對(duì)其進(jìn)行CDS (coding domain sequence)區(qū)域預(yù)測(cè)，檢索其中的NBS-ARC家族基因并進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析、染色體定位、保守結(jié)構(gòu)域分析和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，為三裂葉薯的抗病研究及甘薯的抗性育種提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

三裂葉薯(Ipomoea triloba)全基因組序列從https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Ipomoea triloba L.下載，共16條染色體的DNA序列。

1.2 基因注釋

通過(guò)snap程序應(yīng)用擬南芥(At.hmm)、線蟲(chóng)(Ce.hmm)和水稻(Os.hmm)的HMM模型對(duì)三裂葉薯全基因組序列CDS區(qū)域進(jìn)行檢索，所得作為訓(xùn)練三裂葉薯特異HMM模型的文件(Itl.hmm), 后以Itl.hmm作為檢索工具預(yù)測(cè)屬于三裂葉薯基因組的CDS區(qū)域，并得到其全基因組蛋白質(zhì)序列。

1.3 基因預(yù)測(cè)

通過(guò)pfam下載含有NB-ARC家族序列信息的HMM文件(PF00931)，作為檢索序列對(duì)三裂葉薯的全基因組蛋白質(zhì)序列進(jìn)行NB-ARC結(jié)構(gòu)域搜索。從中選取可用序列(E-value≤1E-60)，用Sam- tools構(gòu)建三裂葉薯的NB-ARC蛋白本地?cái)?shù)據(jù)文件，同時(shí)，用Clustal Omega進(jìn)行比對(duì)并用hmmbuild建立三裂葉薯特異HMM模型，并再次檢索全基因組蛋白序列預(yù)測(cè)NB-ARC結(jié)構(gòu)域，得到三裂葉薯高特異的NB-ARC序列信息。最后導(dǎo)入NCBI Conserved Domains Tool和Interproscan進(jìn)行篩選，剔除結(jié)構(gòu)域缺失嚴(yán)重序列，得到三裂葉薯NB-ARC基因家族蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 保守結(jié)構(gòu)域分類

從Pfam中下載TIR HMMs、RPW8 HMMs和LRR HMMs模型，合并后用hmmpress程序建立TRL.hmm模型，隨后通過(guò)hmmscan對(duì)三裂葉薯的NBS-LRR家族基因信息庫(kù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，并結(jié)合Interproscan查看結(jié)果對(duì)TIR/RPW8/LRR結(jié)構(gòu)域進(jìn)行類型分類和統(tǒng)計(jì)。運(yùn)用Pepcoil與Paircoil2對(duì)三裂葉薯NBS-LRR家族基因編碼的蛋白質(zhì)序列中的CC結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)和檢測(cè)。

1.5 染色體定位

對(duì)三裂葉薯16條染色體上的NBS-LRR家族基因位置信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)其在染色體上的位置分成上、中、下3個(gè)部分，每個(gè)部分按照N、NL、CN、CNL、TN、TNL和RN共7個(gè)類型進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。

1.6 基序分析

將三裂葉薯NBS-LRR家族基因進(jìn)行分類整理后，從中篩選出CC-NBS-LRR、TIR-NBS-LRR和RPW8-NBS共3種NBS亞家族類型的氨基酸序列。保守基序的分析與識(shí)別通過(guò)MEME進(jìn)行，并將運(yùn)行后得到的.xml文件利用TBtools進(jìn)行處理。

1.7 進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

將篩選得到的3種NBS-LRR亞家族類型編碼的CC-NBS-LRR、TIR-NBS-LRR和RPW8-NBS氨基酸序列利用Clustal Omega程序進(jìn)行多序列比對(duì),隨后使用Gblocks提取保守序列，進(jìn)一步用Jalview手動(dòng)矯正。以比對(duì)結(jié)果為基礎(chǔ)，應(yīng)用MEGA X軟件,Maximum Likehood法模式為WAG with Freqs. (+F)model，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap=500運(yùn)行生成三裂葉薯NBS-LRR基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 NB-ARC基因鑒別及其分類

采用snap程序?qū)θ讶~薯全基因組序列進(jìn)行CDS區(qū)域識(shí)別預(yù)測(cè)，經(jīng)篩選后獲得282個(gè)NB-ARC家族基因，占全基因組基因數(shù)(98025)的0.288%。根據(jù)TIR/RPW8/LRR結(jié)構(gòu)域和CC結(jié)構(gòu)域，這些基因可進(jìn)一步分為N (NBS)、NL (NBS-LRR)、CN (CCNBS)、CNL (CC-NBS-LRR)、TN (TNL-LRR)、TNL(TNL-NBS-LRR)和RN (RPW8-NBS)共7個(gè)亞家族類型(表1)，分別有80、83、28、57、10、23和1個(gè)基因。不同基因的NBS/LRR結(jié)構(gòu)域重復(fù)數(shù)不同, 在染色體中的分布位置也存在差異。此外，還含有馬鈴薯抗X病毒和類似蛋白的RX-CC_like結(jié)構(gòu)域(coiled coil domain of the potato virus X resistance protein and similar proteins)，即Cx結(jié)構(gòu)域，與Pepcoil程序得到的CC結(jié)構(gòu)域不同。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)和差異,將NBS/LRR基因類型進(jìn)一步分為40個(gè)小類(表1)。

表1 三裂葉薯NBS-LRR基因的數(shù)量和分類Table 1 Number and type of NBS-LRR genes of Ipomoea triloba

續(xù)表(Continued)

2.2 NBS-LRR家族基因的染色體分布

NBS-LRR家族基因在三裂葉薯16條染色體上的分布差異明顯(表2)，不同的亞家族類型，CN型、CNL型、N型、NL型、TN型、TNL型和RN型在各染色體上的數(shù)量和位置較不均勻。在第16號(hào)染色體僅有1個(gè)NBS-LRR家族基因，而在第15號(hào)染色體多達(dá)65個(gè)。NBS-LRR家族基因在染色體的位置也有差異，第4、13和14號(hào)染色體的NBS-LRR家族基因主要位于染色體的中部和上部，而在第7、11和15號(hào)染色體則以中部和下部居多(表2)。

表2 三裂葉薯NBS-LRR家族基因在染色體上的分布Table 2 Chromosomal location of NBS-LRR family genes of Ipomoea triloba

NBS-LRR家族基因在各染色體上分布形式也存在明顯不同，有些是以單基因分布于染色體，而有些則以基因簇的形式存在。三裂葉薯每條染色體上的基因簇?cái)?shù)量也存在較大差異，如第15號(hào)染色體的基因簇最多，有10個(gè)；第16號(hào)染色體則沒(méi)有基因簇(表3)。所有染色體總共有55個(gè)基因簇，包含了179個(gè)NBS-LRR基因，占NBS-LRR家族基因總基因數(shù)(282)的63.5%。

2.3 基序分析

分別將三裂葉薯NBS-LRR蛋白家族中CNL和TNL亞家族氨基酸序列信息利用MEME程序檢測(cè),得到15個(gè)相似度較高的結(jié)構(gòu)域。CNL亞家族氨基酸序列(共57條)結(jié)構(gòu)域的分布(圖1)有以下規(guī)律:motif 9-motif 10-motif 1 (P-loop)-motif 4 (RNBS-A)-motif 2 (kinase 2)-motif 15 (RNBS-C)-motif 6(GLPL)-motif 8-motif 3 (RNBS-D)-motif 12-motif7-motif 11-motif 14-motif 11-motif 5-motif 13。TNL亞家族氨基酸序列(共22條)結(jié)構(gòu)域的分布有以下規(guī)律(圖2)：motif 11 (TIR-1)-motif 3 (TIR-2)-motif 1(TIR-3)-motif 13 (TIR-4)-motif 5 (P-loop)-motif 10-motif 2 (kinase 2)-motif 9 (RNBS-B)-motif 4 (RNBSC)-motif 14 (GLPL)-motif 6-motif 8 (RNBS-D)-motif 7 (MHDV)-motif 12-motif 15-motif 12-motif 15。

表3 三裂葉薯NBS-LRR基因家族基因簇統(tǒng)計(jì)表Table 3 Statistics of NBS-LRR family gene clusters in Ipomoea triloba

圖1 三裂葉薯NBS-LRR基因家族中CNL亞家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域分布Fig. 1 Distribution of conservative domains of CNL subfamily proteins in NBS-LRR gene family of Ipomoea triloba

2.4 結(jié)構(gòu)域保守性分析

在植物的NBS-LRR蛋白家族中NB-ARC區(qū)域相對(duì)保守，通常有8個(gè)保守基序[8]: P-loop、RNBS-A、Kinase2、RNBS-B、RNBS-C、GLPL、RNBS-D和MHDV。對(duì)三裂葉薯NBS-LRR家族氨基酸序列利用Clustal Omega篩選出20條序列進(jìn)行多重比對(duì),結(jié)果表明，具有5個(gè)保守性較高的結(jié)構(gòu)域[9-11](圖3),分別為P-loop (Kinase 1)、Kinase 2、RNBS-B、GLPL和MHDV。其中P-loop、Kinase 2、RNBS-B、GLPL、MHDV最保守的氨基酸序列分別為SIV GMGGI GKTT+AR++F (下劃線為氨基酸保守性較強(qiáng)序列)、R+LLVLDDV、GS+I+LTTR++++L、AGGLPLAL+V+G、GKMHDLV++MG。

根據(jù)MEME結(jié)構(gòu)域搜索結(jié)果，對(duì)CNL和TNL亞家族基因結(jié)構(gòu)域進(jìn)行基因識(shí)別和定位[12]。從表4可見(jiàn)，TNL和CNL亞家族中分別有11和7個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中TNL亞家族NB-ARC結(jié)構(gòu)域中保守基序分別為P-loop、Kinase 2、RNBS-B、RNBS-C、GLPL、RNBS-D和MHDV，缺失RNBS-A保守基序。CNL亞家族NB-ARC結(jié)構(gòu)域保守基序分別為P-loop、RNBS-A、Kinase 2、RNBS-C、GLPL、RNBSD和MHDV，缺失RNBS-B保守基序。TNL和CNL亞家族中共有的保守基序分別為P-loop (Kinase 1)、Kinase 2、RNBS-C、GLPL、RNBS-D和MHDV。此外，在TNL亞家族中TIR結(jié)構(gòu)域檢測(cè)到4個(gè)保守基序(TIR 1~TIR 4)[13]。

2.5 NBS-LRR亞家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將三裂葉薯的NBS-LRR家族蛋白中CC/TIR/RPW8/NBS/LRR結(jié)構(gòu)域序列分別提取，使用MEGA X構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖4)，可見(jiàn)有3個(gè)明顯的分支，分別為CNL型(藍(lán)色)、TNL型(紫色)和RN型(黃色)。進(jìn)化樹(shù)分支中有些基因分支路徑很長(zhǎng)，如CP025666.1-snap.8798、CP025670.1-snap.5147等,推測(cè)這類基因的“祖先”基因在較早時(shí)即已發(fā)生分化，相應(yīng)的基因序列也發(fā)生了較大的變化。有些基因序列的分支距離較近, 如CP025666.1-snap.1140和CP025666.1-snap.1141、CP025663.1-snap.531和CP025663.1-snap.532，說(shuō)明這些變化發(fā)生的時(shí)間較晚。

圖2 三裂葉薯TNL亞家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域分布Fig. 2 Distribution of conservative domain of TNL subfamily proteins in Ipomoea triloba

圖3 三裂葉薯CNL和TNL亞家族NB-ARC保守性分析Fig. 3 Conservation analysis of the NB-ARC in CNL and TNL subfamilies in Ipomoea triloba

表4 三裂葉薯NBS-LRR家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域和氨基酸保守性分析Table 4 Conservative domains and amino acids of NBS-LRR family proteins in Ipomoea triloba

3 結(jié)論和討論

植物R基因在長(zhǎng)期的抗病過(guò)程中監(jiān)控識(shí)別病原微生物產(chǎn)生的無(wú)毒基因(Avr)，從而引發(fā)植物細(xì)胞過(guò)敏性壞死，產(chǎn)生免疫反應(yīng)。R基因與Avr基因間互作模式包括直接作用、間接作用和轉(zhuǎn)錄調(diào)控[14]。通過(guò)克隆植物體內(nèi)相關(guān)的抗病R基因，研究其與病原物的互作模式與機(jī)制，或?qū)⑵溥z傳轉(zhuǎn)化到目標(biāo)作物中, 增強(qiáng)作物的抗病能力，有利于提高作物產(chǎn)量,保障生產(chǎn)安全。

圖4 三裂葉薯NBS-LRR家族基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree of NBS-LRR family genes in Ipomoea triloba

甘薯在生產(chǎn)上面臨著許多病害的威脅，如南方薯區(qū)的蔓割病、薯瘟病，北方薯區(qū)的莖線蟲(chóng)病、黑斑病、根腐病等，以及最近時(shí)有發(fā)生的莖腐病等病害，都嚴(yán)重影響甘薯生產(chǎn)的安全。甘薯抗性是產(chǎn)量和品質(zhì)的堅(jiān)實(shí)保證[15]，因而抗性育種是甘薯育種的重要方向。甘薯種質(zhì)資源是甘薯育種工作的基礎(chǔ)[16],然而，甘薯種質(zhì)資源在新品種育種工作中存在利用率低、育成品種遺傳背景狹窄、優(yōu)秀資源篩選困難等問(wèn)題[17-18]。因此，如何充分發(fā)掘、利用野生種質(zhì)資源，拓寬甘薯遺傳背景，對(duì)于選育具有突破性的甘薯新品種具有重要意義。研究表明，甘薯與其近緣野生種三裂葉薯雜交不親和，無(wú)法直接利用其抗性基因，但應(yīng)用原生質(zhì)體細(xì)胞融合法可以獲得三裂葉薯和甘薯的種間體細(xì)胞雜種植株，或者可以通過(guò)克隆其抗性基因，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化提高栽培種甘薯的抗性水平，以充分發(fā)揮三裂葉薯基因資源在甘薯育種中的巨大潛力[5,19-20]。

值得注意的是，甘薯栽培種為同源異源六倍體，三淺裂野牽牛(I. trifida)存在二倍體、四倍體和六倍體，一套染色體均為15條，但數(shù)據(jù)庫(kù)中三裂葉薯基因組的染色體數(shù)為16，本文即以三裂葉薯16條染色體的全基因組序列為研究對(duì)象開(kāi)展了相關(guān)的研究，研究結(jié)果有待于與甘薯和三淺裂野牽?；蚪M進(jìn)行進(jìn)一步的比較，分析它們之間的異同之處，將有利于甘薯的進(jìn)化研究和育種工作。

對(duì)作物全基因組NBS-LRR基因進(jìn)行鑒定分析,有利于其抗性資源的應(yīng)用[21]，本研究對(duì)三裂葉薯全基因組蛋白序列進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并鑒定、篩選了NBS-LRR類抗病基因，獲得NBS-LRR家族基因的數(shù)量、在染色體上定位與分布，分析了基因結(jié)構(gòu)域特點(diǎn),構(gòu)建了進(jìn)化樹(shù)，為進(jìn)一步發(fā)掘其抗性基因資源，研究甘薯抗病分子機(jī)制，提高甘薯抗性育種水平提供了參考。