榮 寧 汪 曣 范真真

(天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院 天津 300072)

0 引言

作為一種非病毒式、非侵入性的方法，超聲和靶向微泡結(jié)合在藥物導(dǎo)入及基因治療方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛能[1?4]。然而體外細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境差異巨大，導(dǎo)致體外研究成果難以直接應(yīng)用到臨床治療。近年來，越來越多的證據(jù)表明細(xì)胞生長環(huán)境的物理特性對細(xì)胞形貌以及功能具有顯著影響[5?6]。研究表明，單獨調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)剛性可以實現(xiàn)對細(xì)胞遷移、增殖甚至分化等復(fù)雜過程的調(diào)控[7?8]。研究表明，微泡對不同模式的超聲激勵產(chǎn)生了不同程度的放大聚焦作用[9?10]，在超聲激勵下微泡空化[11]會引發(fā)細(xì)胞膜周圍的流體作用[12]，進而影響細(xì)胞膜表面有小孔打開，使得藥物和外源基因得以進入細(xì)胞實現(xiàn)藥物和基因的導(dǎo)入和治療。質(zhì)粒DNA 的轉(zhuǎn)染過程是一個復(fù)雜的生物物理過程，該過程與微泡的空化以及細(xì)胞功能等密切相關(guān)[13?14]。體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗常用的培養(yǎng)皿材質(zhì)通常為玻璃(彈性模量值為5.1～11.9 GPa[15]) 或塑料(彈性模量值為0.1 GPa[16])，而在體組織的基質(zhì)剛性范圍則在100 kPa 以內(nèi)，腦組織的基質(zhì)剛性甚至在1 kPa 以下[7]。體外細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)皿基質(zhì)剛性比體內(nèi)組織的剛性高出幾個數(shù)量級，這就影響了體外細(xì)胞研究成果向臨床治療的轉(zhuǎn)化。基質(zhì)剛性如何影響質(zhì)粒DNA 的轉(zhuǎn)染效果尚不清楚。本文旨在探究細(xì)胞外基質(zhì)剛性對質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染效果的影響及規(guī)律。制作不同剛性的凝膠基質(zhì)進行基因轉(zhuǎn)染實驗，獲取到基質(zhì)剛性對質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果的影響。并對不同基質(zhì)剛性上的轉(zhuǎn)染實驗進行質(zhì)粒DNA示蹤，以期獲取質(zhì)粒在不同剛性基質(zhì)上進入細(xì)胞方式的差異。進一步的細(xì)胞骨架蛋白分布從實驗角度揭示產(chǎn)生轉(zhuǎn)染效果差異的原因。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗材料

為了制作不同硬度的凝膠基質(zhì)，采用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilane,APES)、二氯二甲基硅烷(Dichlorodimethylsilane,DCDMS)、25%(體積比)戊二醛溶液、40%(質(zhì)量體積比)丙烯酰胺原液、2%(質(zhì)量體積比)雙丙烯酰胺溶液、四甲基乙二胺(Tetramethylethylenediamine,TEMED)、過硫酸銨(Ammonium persulfate,APS)以及交聯(lián)劑sulfo-SANPAH 等試劑，均購自sigma公司。力學(xué)信號敏感的小鼠成纖維細(xì)胞NIH 3T3采用10%胎牛血清+90%高糖DMEM 以及1%雙抗培養(yǎng)。選用SIM4-5 超聲微泡，購自Advanced Microbubbles laboratories LLC 公司。RGD 多肽用于將微泡造影劑靶向連接在細(xì)胞膜表面。超聲實驗示意圖如圖1所示。

圖1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗示意圖Fig.1 Schematic illustration of plasmid transfection

1.2 實驗方法

凝膠基質(zhì)制作參考文獻[17]中的方法，通過調(diào)節(jié)丙烯酰胺單體和雙體比例實現(xiàn)對凝膠基質(zhì)剛性的調(diào)節(jié)。制作硬度不同的凝膠基質(zhì)，采用原子力顯微鏡赫茲模型對凝膠基質(zhì)的楊氏模量進行檢測。最終用于實驗的軟的凝膠基質(zhì)測得的楊氏模量值為(0.2±0.05) kPa，硬的凝膠基質(zhì)楊氏模量為(40±1.2) kPa。I型膠原蛋白溶液稀釋到50 μg/mL，滴加到用Sulfo-SANPAH 活化過的凝膠基質(zhì)上，室溫靜置過夜，使膠原蛋白溶液充分吸附到凝膠基質(zhì)表面。傳代前向凝膠基質(zhì)表面加入完全培養(yǎng)基室溫孵育30 min。將攜帶凝膠的玻璃底培養(yǎng)皿置于生物安全柜內(nèi)紫外滅菌0.5 h。將NIH 3T3 傳代到凝膠基質(zhì)上，細(xì)胞密度為104細(xì)胞/cm2。37?C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞融合度達到60%。

選用攜帶增強型綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的質(zhì)粒DNA進行基因轉(zhuǎn)染實驗。選擇單脈沖串超聲激勵，聲壓在0.45 MPa，超聲持續(xù)10 μs。質(zhì)粒DNA 濃度為10 μg/ml。超聲激勵結(jié)束后將細(xì)胞更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)放回二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況，并計算轉(zhuǎn)染效率。為了研究凝膠基質(zhì)的剛性對聲致穿孔誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA 導(dǎo)入效果的影響，對細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒DNA 進行示蹤，采用Cy3對質(zhì)粒DNA進行熒光標(biāo)記。用Cy3標(biāo)記過的質(zhì)粒DNA進行超聲實驗。超聲激勵前，采用Hoechst 33342 對細(xì)胞核染色。超聲激勵結(jié)束后5 min，采用4%多聚甲醛室溫下對細(xì)胞固定10 min。磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline,PBS)沖洗2次。共聚焦顯微鏡三維層掃細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒DNA分布。層掃間距為1 μm。

采用FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對細(xì)胞骨架蛋白進行染色，對照組對分別培養(yǎng)在0.2 kPa 和40 kPa 硬度的凝膠基底上的細(xì)胞進行固定染色。實驗組選用聲壓為0.45 MPa 的單脈沖串超聲對分別培養(yǎng)在0.2 kPa和40 kPa硬度的凝膠基底上的細(xì)胞進行超聲激勵。超聲脈沖串持續(xù)時間為10 μs。超聲激勵后40 s 吸走培養(yǎng)皿內(nèi)的PBS 緩沖液，采用4%的多聚甲醛溶液立即對超聲激勵后的細(xì)胞固定10 min。PBS 緩沖液沖洗3 次，加入FITC 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，終濃度為10μg/mL。室溫孵育40 min。PBS緩沖液沖洗3次。滴加10 μL Hoechst 33342溶液進行細(xì)胞核染色10 min。共聚焦顯微鏡(Olympus FV3000，60倍油鏡)三維掃描熒光成像。

每組實驗至少重復(fù)3 次。采用Origin 8.5 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)采用平均值± 均方根(x±m(xù))表示。采用單因素方差分析比較各實驗組結(jié)果存在的差異，以p <0.05 具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)剛性對質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效果的影響

將NIH 3T3 細(xì)胞分別培養(yǎng)在楊氏模量值為0.2 kPa、3 kPa、10 kPa、20 kPa、40 kPa的凝膠基質(zhì)上，如圖2所示，細(xì)胞培養(yǎng)在 10 kPa的凝膠基質(zhì)上時細(xì)胞形貌差別不大，細(xì)胞呈現(xiàn)出成纖維細(xì)胞梭形形貌。而0.2 kPa 凝膠上的細(xì)胞形貌則呈現(xiàn)出圓形，與40 kPa 凝膠上的細(xì)胞形貌差異很大。因此最終選取了0.2 kPa和40 kPa兩個參數(shù)研究基質(zhì)剛性對質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染效果的影響。這兩個彈性模量值也是參考文獻中研究基質(zhì)剛性對細(xì)胞功能影響實驗中常見的具有代表性的數(shù)值[7,18?19]。

如圖3(a)、圖3(b)所示，不同剛性的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞，在超聲激勵后24 h，細(xì)胞形貌仍然保持顯著性差異。軟的凝膠基質(zhì)上的細(xì)胞保持圓形，細(xì)胞面積更小，硬的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞延展性更好，細(xì)胞保持梭形狀態(tài)，細(xì)胞表面積更大。由綠色熒光蛋白的表達情況來看，質(zhì)粒DNA 均可以成功導(dǎo)入進細(xì)胞并實現(xiàn)表達。

圖2 不同剛性凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞形貌Fig.2 Cell morphology cultured on hydrogel with different rigidities

質(zhì)粒DNA 綠色熒光蛋白的表達效率e采用熒光顯微成像的方法收集數(shù)據(jù)，超聲實驗時對超聲作用區(qū)域用馬克筆進行標(biāo)記。超聲激勵前后靶向微泡的響應(yīng)采用倒置熒光顯微鏡進行記錄。統(tǒng)計該視野下微泡發(fā)生響應(yīng)的細(xì)胞比例α。超聲激勵后24 h，對超聲激勵區(qū)域用倒置熒光顯微鏡拍攝綠色熒光，計數(shù)超聲激勵區(qū)域表達綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量β，以及同一視野下的細(xì)胞總數(shù)N。

如圖3(c)所示，在相同的超聲條件激勵下(0.45 MPa,10 μs)，硬的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，綠色熒光蛋白的表達效率顯著高于軟的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞。

圖3 綠色熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達Fig.3 GFP expression in NIH 3T3 cells

圖4 質(zhì)粒DNA 在細(xì)胞內(nèi)的分布Fig.4 Plasmid DNA intracellular distribution

2.2 基質(zhì)剛性對質(zhì)粒DNA導(dǎo)入方式的影響

為了進一步研究造成不同剛性基質(zhì)上質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率差異的原因，對質(zhì)粒DNA 進行熒光標(biāo)記示蹤。由圖4熒光圖像可知，兩種不同硬度的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞，在靶向微泡位點附近均有質(zhì)粒DNA嵌入到細(xì)胞膜，表明對于兩種不同硬度凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞，質(zhì)粒DNA 均可以通過聲致穿孔產(chǎn)生的細(xì)胞膜小孔被導(dǎo)入進細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞被培養(yǎng)在軟的凝膠基質(zhì)(0.2 kPa)上，細(xì)胞內(nèi)在遠(yuǎn)離微泡位點的空間內(nèi)觀察到更多尺度在微米級的質(zhì)粒DNA團簇，表明質(zhì)粒DNA同時可以通過其他方式進入細(xì)胞內(nèi)。對質(zhì)粒DNA 在細(xì)胞內(nèi)的空間分布進行量化分析可知，軟的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞可以攝取更多的質(zhì)粒DNA，如圖5(a)所示。但硬的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞，與靶向微泡位點吻合的質(zhì)粒DNA 比例更高，推測當(dāng)細(xì)胞被培養(yǎng)在硬的凝膠基質(zhì)上時聲致穿孔引發(fā)的細(xì)胞膜小孔是質(zhì)粒DNA 實現(xiàn)轉(zhuǎn)染并表達的更為有效的方式。將細(xì)胞內(nèi)距離細(xì)胞膜5 μm 的范圍劃為細(xì)胞外周，距離細(xì)胞膜大于5 μm 則劃為細(xì)胞內(nèi)周，統(tǒng)計整個細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒DNA 熒光強度以及細(xì)胞外周的質(zhì)粒DNA 熒光強度。細(xì)胞邊緣質(zhì)粒DNA 的百分率b為細(xì)胞膜附近5 μm 范圍內(nèi)DNA熒光強度值除以整個細(xì)胞內(nèi)的DNA 熒光強度值。細(xì)胞中心DNA 的熒光強度值則為1?b。由圖5(c)可知，培養(yǎng)在硬的凝膠基質(zhì)上有更多比例的質(zhì)粒DNA快速向細(xì)胞內(nèi)部轉(zhuǎn)移。

圖5 質(zhì)粒DNA 在細(xì)胞內(nèi)的分布統(tǒng)計Fig.5 Statistics of plasmid DNA intracellular distribution

圖6 不同剛性基質(zhì)上細(xì)胞骨架蛋白(F 肌動蛋白)分布Fig.6 Intracellular distribution of F-actin in cells cultured on different rigidities

2.3 基質(zhì)剛性對細(xì)胞骨架蛋白的影響

培養(yǎng)在不同剛性凝膠基質(zhì)上的細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的F肌動蛋白分布規(guī)律顯著不同。如圖6(a)、圖6(b)未打超聲的對照組所示，培養(yǎng)在軟的凝膠基質(zhì)上的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白更多以分散或團簇形式分布，而培養(yǎng)在硬的凝膠基質(zhì)上的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白則以肌動蛋白纖維絲的形態(tài)分布。兩種不同剛性基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞在靶向微泡連接位點處均可觀察到小的肌動蛋白“團聚”現(xiàn)象，表明在靶向微泡連接位點處均有黏著斑形成。超聲激勵組如圖6(c)、圖6(d)所示，軟的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞在超聲激勵后40 s 由于球形蛋白分布更有利于細(xì)胞膜流動，細(xì)胞膜表面小孔完成修復(fù)，微泡附近的肌動蛋白“團聚”現(xiàn)象消失。而硬的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞，纖維狀肌動蛋白主要起到支撐作用，小孔愈合更多需要借助肌球蛋白運動等過程完成，因此細(xì)胞膜上的小孔愈合過程尚未完成，在靶向微泡位點處可以觀察到更大的蛋白“團聚”，推測這與質(zhì)粒DNA 的攝取方式有關(guān)。軟的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)胞膜流動性更強，更容易發(fā)生內(nèi)吞作用將質(zhì)粒DNA 攝入細(xì)胞內(nèi)。硬的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞肌動蛋白更多以纖維絲狀結(jié)構(gòu)存在，此時會預(yù)留更多的時間供質(zhì)粒DNA通過小孔進入細(xì)胞。

3 結(jié)論

本文實驗研究了基質(zhì)剛性對質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染效果的影響，并對質(zhì)粒DNA 導(dǎo)入細(xì)胞的方式進行進一步研究。獲悉培養(yǎng)在不同剛性基質(zhì)上的細(xì)胞，由于不同種類的質(zhì)粒DNA 攝取方式所占比重有所差異，導(dǎo)致DNA 的表達效果顯著不同，硬的凝膠基質(zhì)上聲致穿孔引發(fā)的細(xì)胞膜小孔可以作為質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染更為有效的途徑，質(zhì)粒的表達效果也更好。進一步的細(xì)胞骨架蛋白分布結(jié)果揭示了不同硬度基質(zhì)上的細(xì)胞攝取質(zhì)粒DNA 方式差異的原因可能來自于細(xì)胞骨架蛋白的形態(tài)差異，該差異導(dǎo)致軟的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞更容易以非物理小孔的方式將質(zhì)粒DNA 攝入細(xì)胞，而硬的凝膠基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞則可以更多的通過聲致穿孔產(chǎn)生的小孔攝入質(zhì)粒DNA。這對理解細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的物理特性差異引起的基因類藥物導(dǎo)入效果差異具有重要的指導(dǎo)意義。但受到實驗條件的限制，未能實驗檢測出引起質(zhì)粒DNA 導(dǎo)入的動力——微泡對超聲的動力學(xué)響應(yīng)。進一步工作將聯(lián)合高速顯微成像系統(tǒng)對引起質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的動力學(xué)因素——微泡振動以及微流體剪切力進行檢測分析，深入挖掘基質(zhì)剛性引起質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染差異的原因?；|(zhì)的物理剛性對細(xì)胞形貌以及力學(xué)特性影響顯著，進一步工作將對基質(zhì)剛性引起的細(xì)胞形貌差異對質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染差異的影響規(guī)律進行研究。