隋 怡，楊 平，夏仁俠

(貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

黔產(chǎn)刺梨(Rosa roxburghii)為薔薇科多年生落葉灌木繅絲花的果實(shí)，又名茨梨、文先果，產(chǎn)自貴州西部，其富含大量的維C和SOD等多種成分?！顿F州民間方藥集》記載其功效為“健胃，消食積飽脹，并滋補(bǔ)強(qiáng)壯”。《四川中藥志》中記載刺梨“解暑，消食”。現(xiàn)代研究表明刺梨還具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、延緩衰老、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗腫瘤等功能。其果實(shí)為藥食兩用的天然植物。

肥胖是全球流行病。人們的飲食和生活方式的改變是肥胖病例增長(zhǎng)的主要原因，其并發(fā)癥包括糖尿病和癌癥[1]。因此，預(yù)防肥胖將有助于預(yù)防其并發(fā)癥，從而改善肥胖患者的生活質(zhì)量。肥胖及其并發(fā)癥與炎癥過(guò)程密切相關(guān)[2]，如TNF-α可直接降低胰島素敏感性[3-5]。而脂肪組織巨噬細(xì)胞是脂肪組織中TNF-α和其他促炎因子的主要來(lái)源[2]。由于刺梨等天然藥食兩植物中含有維生素C等天然抗炎成分，使這些植物治療肥胖成為可能。

基于以上研究及黔產(chǎn)刺梨“消食”作用，我們考察了ig黔產(chǎn)刺梨果汁對(duì)昆明種小鼠體質(zhì)量的影響，同時(shí)考察用刺梨含藥血清和刺梨果汁孵育后，對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7細(xì)胞)的PPAR-α、PPAR-γ及對(duì)IL-6、IL-10基因表達(dá)的影響。為進(jìn)一步探討基于黔產(chǎn)刺梨“消食”作用的減肥活性及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與細(xì)胞 SPF級(jí)健康成年雄性昆明種小鼠，體重18～22 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙天勤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2009-0012。SPF級(jí)健康成年雄性SD種大鼠，體重180～220 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙天勤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0014。小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7細(xì)胞)，購(gòu)自上海奧陸生物科技有限公司。

1.1.2 試劑 RNAiso Plus(TaKaRa公司，貨號(hào)9108)、PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa公司，貨號(hào)RR047A)、TB Green(Takara公司，貨號(hào)RR820A)、引物設(shè)計(jì)與合成(上海捷瑞生物工程有限公司)、DEPC水(碧云天，貨號(hào)R0021)。

1.1.3 主要儀器 JA2003N型電子天平(上海菁海儀器有限公司)、ND-2000(NaNoDop 2000)微量紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)、22331型多功能梯度PCR儀(Matercycler gradient，德國(guó)Eppendorf公司)、CFX-connect型熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 黔產(chǎn)刺梨果汁與刺梨含藥血清的制備 新鮮黔產(chǎn)金刺梨10 kg，加適量雙蒸水榨汁，取雙蒸水定容至6 L，制備含生藥1.66 kg·L-1刺梨果汁備用。取此刺梨果汁，用DMEM高糖培養(yǎng)基定容，制成含果汁15%的刺梨果汁備用。

SD健康雄性成年大鼠30只，180～220 g，隨機(jī)分5個(gè)大鼠籠飼養(yǎng)，每籠6只，每日給予正常飲食和飲水，每日ig給予刺梨果汁(含生藥濃度為1.66 kg·L-1)，每日2次，兩次之間間隔4 h。連續(xù)給藥7天，末次給藥1 h后處死各組大鼠，取血，離心分離血清，取血清過(guò)0.22 μm微孔濾膜除菌，取刺梨含藥血清，用DMEM高糖培養(yǎng)基定容，制成含血清15%的刺梨含藥血清備用。

1.2.2 黔產(chǎn)刺梨果汁對(duì)小鼠體質(zhì)量影響 昆明種小鼠20只，SPF級(jí)健康成年雄性，體重18～22 g，分為正常組(ig，生理鹽水)和刺梨果汁組(ig，含生藥1.66 kg·L-1)，每組10只，各組小鼠每日ig給藥1次，連續(xù)給藥6天，觀測(cè)小鼠體質(zhì)量并記錄。

1.2.3 小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)、分組、造模與給藥 培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，用含10%胎牛血清，1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。分為9組：正常組、刺梨含藥血清組、刺梨果汁組、M1組、M1+刺梨含藥血清組、M1+刺梨果汁組、M2組、M2+刺梨含藥血清組、M2+刺梨果汁組，每組3個(gè)復(fù)孔。其中刺梨含藥血清組、M1+刺梨含藥血清組、M2+刺梨含藥血清組用含15%刺梨含藥血清的DMEM高糖培養(yǎng)基孵育8 h；刺梨果汁組、M1+刺梨果汁組、M2+刺梨果汁組用含15%刺梨果汁的DMEM高糖培養(yǎng)基孵育8 h。之后造模：M1組、M1+刺梨含藥血清組、M1+刺梨果汁組用脂多糖(LPS)100 ng·mL-1孵育12 h，誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型巨噬細(xì)胞；M2組、M2+刺梨含藥血清組、M2+刺梨果汁組用IL-4 10 ng·mL-1孵育12 h，誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型巨噬細(xì)胞。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞PPAR-α、PPAR-γ、IL-6和IL-10基因的表達(dá) RNA的提取與純化：取各組RAW264.7細(xì)胞，按RNAiso Plus試劑盒說(shuō)明書提取各組RNA，RNA沉淀用DEPC水100 μL溶解備用。RNA純度檢測(cè)、濃度計(jì)算與稀釋：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度，OD260/OD280>1.7認(rèn)為RNA純度達(dá)到要求，RNA濃度(ng·μL-1)=OD260·40。按檢測(cè)的RNA濃度用DEPC水稀釋，配制200 ng·μL-1的RNA樣品稀釋液50 μL備用。逆轉(zhuǎn)錄：取6 μLRNA稀釋液按PrimeScript RT reagent Kit試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用DEPC水稀釋成濃度為10 ng·μL-1備用。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR所用引物

逆轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃×10 min，37 ℃×2 h，85 ℃×5 min，4 ℃后取出。

PCR擴(kuò)增：配置15 μL反應(yīng)體系，包括3 μL cDNA稀釋液、7.5 μL TB Green、0.5 μL混合引物(表1)、4 μL DEPC水。反應(yīng)條件：95 ℃×10 min，3個(gè)循環(huán)；95 ℃×10 s，60 ℃×1 min，40個(gè)循環(huán)；95 ℃×1 min，55 ℃×1 min，55 ℃×10 s，80個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，根據(jù)結(jié)果對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。

基因相對(duì)表達(dá)(%)=目的基因的表達(dá)/內(nèi)參基因的表達(dá)×100%

2 結(jié)果

2.1 黔產(chǎn)刺梨果汁ig給藥對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

黔產(chǎn)刺梨果汁對(duì)小鼠體質(zhì)量影響結(jié)果如圖1，從ig給藥第5天開始，與正常組小鼠相比，刺梨果汁組小鼠體質(zhì)量開始下降，在給藥第6天時(shí)明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)。如圖1所示。

注：與同時(shí)間正常組相比，*P<0.05。

2.2 黔產(chǎn)刺梨含藥血清、刺梨果汁對(duì)RAW264.7細(xì)胞PPAR-α、PPAR-γ基因表達(dá)的影響

如表2所示，與M1組相比，M1+刺梨含藥血清組、M1+刺梨果汁組PPAR-α基因相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.05)；M1+刺梨含藥血清組PPAR-γ基因相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與M2組相比，M2+刺梨含藥血清組PPAR-α基因相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.05)；M2+刺梨果汁組PPAR-γ基因相對(duì)表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

2.3 黔產(chǎn)刺梨含藥血清、刺梨果汁對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL-6、IL-10基因表達(dá)的影響

如表3所示，與正常組相比，刺梨果汁組、M1組、M2組IL-6基因相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與M1組相比，M1+刺梨含藥血清組、M1+刺梨果汁組IL-6基因相對(duì)表達(dá)顯著降低(P<0.05)；M1+刺梨含藥血清組IL-10基因相對(duì)表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與M2組相比，M2+刺梨果汁組IL-6基因相對(duì)表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

表2 黔產(chǎn)刺梨含藥血清、刺梨果汁對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞PPAR-α、PPAR-γ基因表達(dá)的影響

表3 黔產(chǎn)刺梨含藥血清、刺梨果汁對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞IL-6、IL-10基因表達(dá)的影響

3 討論

基于中藥經(jīng)典古籍記載的黔產(chǎn)刺梨“消食”作用，我們?cè)谇a(chǎn)刺梨果汁ig給藥對(duì)小鼠體質(zhì)量影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用刺梨果汁(含生藥1.66 kg·L-1)灌胃小鼠(每日ig給藥1次，連續(xù)給藥6天)，從ig給藥第5天開始，刺梨果汁組小鼠體質(zhì)量開始下降，并給藥第6天時(shí)顯著低于正常組小鼠體質(zhì)量(P<0.05)，顯示了黔產(chǎn)刺梨果汁具有降低小鼠體質(zhì)量的作用。

PPAR-α為脂肪代謝相關(guān)的重要因子，可以促進(jìn)脂肪分解，加快脂肪組織代謝[6]。在誘導(dǎo)后的M1型巨噬細(xì)胞中，刺梨含藥血清和刺梨果汁孵育使RAW264.7細(xì)胞PPAR-α的表達(dá)均顯著升高；在M2型巨噬細(xì)胞中，刺梨血清組PPAR-α的表達(dá)均顯著升高。表明刺梨含藥血清對(duì)M1型和M2型巨噬細(xì)胞均有促進(jìn)PPAR-α基因的表達(dá)作用?？梢?jiàn)黔產(chǎn)刺梨可以促進(jìn)M1型和M2型巨噬細(xì)胞PPAR-α基因的表達(dá)，從而加速機(jī)體的脂肪分解，達(dá)到減肥的作用。

脂肪組織炎癥作用與肥胖之間有密切關(guān)系[2]：在肥胖患者脂肪組織中，M1表型的巨噬細(xì)胞占多數(shù)；在纖瘦的機(jī)體脂肪組織中，M2表型的巨噬細(xì)胞占多數(shù)[3]。肥胖導(dǎo)致脂肪組織巨噬細(xì)胞由M2表型向M1表型轉(zhuǎn)化，M1表型巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子，加重脂肪組織炎癥，最終將導(dǎo)致胰島素抵抗等肥胖并發(fā)癥[7]。PPAR-γ為脂肪組織巨噬細(xì)胞由M1表型向M2表型轉(zhuǎn)化的必須因子[3]。與正常組的小鼠巨噬細(xì)胞相比，M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)的PPAR-γ升高，M2表型的小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)的PPAR-γ降低，這可能是機(jī)體的自我保護(hù)機(jī)制，即當(dāng)機(jī)體脂肪組織巨噬細(xì)胞多為M1表型時(shí)，巨噬細(xì)胞PPAR-γ表達(dá)升高，使其向M2表型轉(zhuǎn)化，而當(dāng)機(jī)體巨噬細(xì)胞多為M2表型時(shí)，機(jī)體又會(huì)抑制PPAR-γ的表達(dá)。與M1表型巨噬細(xì)胞組相比，M1+刺梨含藥血清組的PPAR-γ表達(dá)顯著升高，顯示刺梨含藥血清能夠促進(jìn)M1細(xì)胞PPAR-γ的表達(dá)，從而促進(jìn)其向M2表型轉(zhuǎn)化。而M1+刺梨果汁組這一作用較刺梨含藥血清組弱，顯示其作用主要依賴機(jī)體對(duì)刺梨的代謝。

IL-6為重要的致炎因子，由M1型巨噬細(xì)胞分泌[8]。與正常未分化組相比，M1表型組的IL-6顯著升高，顯示造模成功；與M1組相比，M1+刺梨含藥血清組與M1+刺梨果汁組均能顯著降低IL-6的表達(dá)，顯示兩者均可以抑制M1型巨噬細(xì)胞炎癥，緩解由肥胖導(dǎo)致的脂肪組織炎癥，減輕胰島素抵抗。與M2組相比，IL-6在M2+刺梨果汁組表達(dá)顯著降低，顯示在M2表型為主的巨噬細(xì)胞中，刺梨果汁具有抗炎作用。

IL-10為抗炎因子，由M2型巨噬細(xì)胞分泌[9-11]。與M1表型巨噬細(xì)胞相比，IL-10在M1+刺梨含藥血清組表達(dá)顯著升高，可能是由于刺梨含藥血清能夠顯著升高M(jìn)1型巨噬細(xì)胞PPAR-γ基因的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)M1表型向M2表型轉(zhuǎn)化所致。與M2表型相比，用刺梨含藥血清孵育后，可以升高抗炎因子IL-10的表達(dá)，顯示刺梨含藥血清可以協(xié)同M2表型的抗炎作用。

綜上所述，黔產(chǎn)刺梨含藥血清可以誘導(dǎo)M1表型巨噬細(xì)胞PPAR-α基因表達(dá)顯著增加，加速脂肪組織分解利用；誘導(dǎo)M1表型巨噬細(xì)胞PPAR-γ基因表達(dá)顯著增加，促使脂肪組織巨噬細(xì)胞由M1表型向M2表型轉(zhuǎn)化；誘導(dǎo)M1表型巨噬細(xì)胞IL-6基因表達(dá)顯著降低和IL-10基因表達(dá)顯著升高，可能與其促進(jìn)脂肪組織巨噬細(xì)胞表型向M2表型轉(zhuǎn)化有關(guān)?；谝陨涎芯堪l(fā)現(xiàn)，今后將進(jìn)一步研究黔產(chǎn)刺梨的減肥活性和抗炎作用，以期發(fā)掘黔產(chǎn)刺梨的減肥藥用價(jià)值并探究其作用機(jī)制。