宿世瓊 倪 青 侯 凈 王 舒 陳 歡

(貴州省人民醫(yī)院乳腺外科，貴陽 550002)

miRNA為非編碼小RNA，長度約19～22 nt，可結合靶基因mRNA 3′端非編碼區(qū)調控靶基因表達，為轉錄后調節(jié)基因，在腫瘤形成及細胞增殖、分化、凋亡、侵襲、遷移等過程中發(fā)揮重要作用，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用。乳腺癌細胞中多種miRNA存在異常表達，參與乳腺癌細胞生長和侵襲遷移[1]。miR-194為miRNA家族成員，參與多種惡性腫瘤細胞的增殖和轉移[2,3]。Wnt/β-catenin通路參與細胞分化、增殖，乳腺癌細胞中存在Wnt/β-catenin通路異常，參與乳腺癌細胞增殖、侵襲遷移[4]。本文對乳腺癌細胞MCF-7中miR-194水平及其對乳腺癌細胞增殖、侵襲遷移和Wnt/β-catenin信號的影響進行研究，探討miR-194對乳腺癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人乳腺癌MCF-7細胞、人正常乳腺Hs578Bst細胞(中國科學院上海細胞庫)，兔抗人GSK-3β單克隆抗體、兔抗人p-GSK-3β單克隆抗體、兔抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗人cyclin-D1單克隆抗體、兔抗人C-Myc單克隆抗體、兔抗人MMP-7單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，ECL化學發(fā)光試劑盒、RT-PCR試劑盒、Trizol試劑、反轉錄試劑盒(美國BPB公司)，脂質體Lipofectamine 2000、MTT試劑、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基(美國Sigma公司)，miR-194 mimic和陰性對照(上海生工生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將MCF-7細胞和Hs578Bst細胞置于RPMI1640(胎牛血清和青霉素-鏈霉素)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細胞融合達90%、呈對數(shù)生長時進行傳代。

1.2.2RT-PCR測定miR-194水平 將MCF-7細胞和Hs578Bst細胞加入Trizol裂解5 min，提取總RNA，分光光度計測定RNA濃度和純度。將RNA逆轉錄為cDNA，RT-PCR測定MCF-7細胞和Hs578Bst細胞中miR-194水平，反應條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共42個循環(huán)。以U6為內參。miR-194水平以2-ΔΔCt表示。

1.2.3MCF-7細胞分組及轉染 MCF-7細胞分為空白對照組(Blank組)、陰性對照組(NC組)和miR-194組。將miR-125b mimic及相應的NC置于EP管，加入NBase-free water 1 000 μl，分裝備用。將各組MCF-7細胞接種于24孔板(1×105個/孔)，每組設置7個復孔，無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，miR-194組加入miR-125b mimic，NC組加入NC存儲液，Blank組不轉染，培養(yǎng)24 h，RT-PCR測定各組MCF-7細胞中miR-194水平，方法同1.2.2。

1.2.4MTT法測定MCF-7細胞增殖活性 取各組對數(shù)生長期的MCF-7細胞加入胰蛋白酶消化細胞，調整各組細胞濃度為5×104個/ml，接種于96孔板，每組設置7個復孔，24、48、72 h在每孔中加入20 μl MTT，孵育4 h，取上清，加入DMSO溶液混勻，酶標儀測定吸光度(OD)值。

1.2.5Transwell小室測定MCF-7細胞侵襲能力 將Matrigel基質膠用DMEM培養(yǎng)基(無血清、無雙抗)按1∶8比例稀釋，均勻包被Transwell小室底部培養(yǎng)1 h，將對數(shù)生長的MCF-7細胞饑餓培養(yǎng)2 h取出，上室中加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，下室加入含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基孵育1 h。收集MCF-7細胞，調整濃度為2×105個/ml，取100 μl加入Transwell小室上室，將含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液加入下室，孵育4 h，PBS洗滌小室上層膜，甲醛固定，結晶紫染色，棉簽擦去附著細胞，觀察MCF-7細胞侵襲情況。

1.2.6劃痕實驗測定MCF-7細胞遷移能力 取各組對數(shù)生長MCF-7細胞接種于6孔板，4×105個/孔，待細胞貼壁生長至覆蓋培養(yǎng)瓶底時，用消毒槍頭(10 ml)垂直孔板底面、沿中軸劃3條平行線，PBS沖洗加入不含胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后顯微鏡下拍照觀察24 h劃痕愈合照片，Visio軟件分析細胞遷移距離。

1.2.7Western blot檢測MCF-7細胞中GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、cyclin-D1、C-Myc、MMP-7蛋白水平 取各組轉染48 h的MCF-7細胞，每組設置7個復孔，加入裂解液裂解30 min，提取總蛋白，取50 μl蛋白樣品上樣，電泳、轉膜、封閉，加入一抗(兔抗人GSK-3β單克隆抗體、兔抗人p-GSK-3β單克隆抗體、兔抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗人cyclin-D1單克隆抗體、兔抗人C-Myc單克隆抗體、兔抗人MMP-7單克隆抗體)孵育過夜，加入二抗封閉1 h，以β-actin為內參，ECL化學發(fā)光顯影，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，Image J軟件分析條帶灰度值，蛋白表達量以蛋白灰度值/β-actin灰度值表示。

2 結果

2.1乳腺癌MCF-7細胞與正常乳腺Hs578Bst細胞miR-194水平比較 乳腺癌MCF-7細胞miR-194水平顯著低于正常乳腺Hs578Bst細胞(0.24±0.05 vs 1.00±0.07,P<0.01)。

2.2各組MCF-7細胞miR-194水平比較 與Blank組和NC組相比，miR-194組miR-194水平升高(P<0.05)，Blank組和NC組miR-194水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組MCF-7細胞中miR-194水平比較

2.3各組MCF-7細胞增殖能力比較 24 h時，各組MCF-7細胞OD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；48 h和72 h時，與Blank組和NC組相比，miR-194組MCF-7細胞OD值降低(P<0.05)，Blank組和NC組MCF-7細胞OD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組MCF-7細胞OD值比較

2.4各組MCF-7細胞侵襲能力 與Blank組和NC組相比，miR-194組MCF-7細胞侵襲細胞數(shù)降低(P<0.05)，Blank組和NC組MCF-7細胞侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3、圖1。

圖1 Transwell測定MCF-7細胞侵襲能力(×400)Fig.1 Transwell to determine invasive ability of MCF-7 cells (×400)

表3 各組MCF-7細胞侵襲細胞數(shù)比較

2.5各組MCF-7細胞遷移能力比較 與Blank組和NC組相比，miR-194組MCF-7細胞遷移距離降低(P<0.05)，Blank組和NC組MCF-7細胞遷移距離差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4、圖2。

圖2 劃痕實驗測定MCF-7細胞遷移能力(×100)Fig.2 Scratch test to determine migration ability of MCF-7 cells (×100)

表4 各組MCF-7細胞遷移距離比較

2.6各組MCF-7細胞GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白水平相比 各組MCF-7細胞GSK-3β蛋白水平相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與Blank組和NC組相比，miR-194組MCF-7細胞p-GSK-3β、β-catenin蛋白水平降低(P<0.05)，Blank組和NC組MCF-7細胞p-GSK-3β、β-catenin蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5、圖3。

表5 各組MCF-7細胞GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白水平比較

圖3 Western blot檢測各組MCF-7細胞GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白水平Fig.3 Western blot detected GSK-3β,p-GSK-3β and β-catenin proteins levels of MCF-7 cells in each group

2.7各組MCF-7細胞cyclin-D1、C-Myc、MMP-7蛋白水平 與Blank組和NC組相比，miR-194組MCF-7細胞cyclin-D1、C-Myc、MMP-7蛋白水平降低(P<0.05)，Blank組和NC組MCF-7細胞cyclin-D1、C-Myc、MMP-7蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表6、圖4。

圖4 Western blot檢測各組MCF-7細胞cyclin-D1、C-Myc、MMP-7蛋白水平電泳圖Fig.4 Western blot detected cyclin-D1,C-Myc and MMP-7 proteins levels of MCF-7 cells in each group

表6 各組MCF-7細胞cyclin-D1、C-Myc、MMP-7蛋白水平比較

3 討論

miRNA為信號分子，具有廣泛的調節(jié)功能，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。miRNA可作為癌基因或抑癌基因，作為促癌基因在惡性腫瘤中表達上調，可通過阻止惡性腫瘤細胞分化、抑制惡性腫瘤細胞凋亡、解除抑癌基因的調控等途徑促進惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展；作為抑癌基因在惡性腫瘤中表達下調或缺失，促進惡性腫瘤細胞增殖作用下降，抑制惡性腫瘤細胞無限增殖[6-8]。miR-194在多種惡性腫瘤中表達異常，參與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展，如miR-194對裸鼠體內骨肉瘤的增殖及肺部轉移具有明顯抑制作用,在裸鼠骨肉瘤中發(fā)揮抑癌基因作用，可通過靶向KDM5B抑制胃癌細胞增殖，在胃癌中發(fā)揮抑癌基因作用，通過調節(jié)BMP1和p27(kip1)表達抑制非小細胞肺癌轉移，因此miR-194在骨肉瘤、胃癌、非小細胞肺癌的惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用[9-12]。本研究對乳腺癌MCF-7細胞miR-194水平進行實驗，發(fā)現(xiàn)MCF-7細胞miR194水平降低，過表達miR-194可抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖、侵襲和遷移。本研究表明miR-194在乳腺癌MCF-7細胞中發(fā)揮抑癌基因作用。在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，Wnt/β-catenin信號通路參與惡性腫瘤增殖、侵襲和遷移，該通路中任何信號分子異常均可引起β-catenin聚集于細胞質和細胞核，促使下游靶基因轉錄活性增強，引起細胞異常增殖[13]。β-catenin是Wnt/β-catenin通路的關鍵分子，在乳腺癌中異常表達，與轉移及不良預后有關；GSK-3β在真核細胞中普遍存在，為保守的絲氨酸、蘇氨酸激酶，GSK-3β磷酸化為p-GSK-3β可調節(jié)細胞增殖、分化及凋亡，可避免β-catenin磷酸化，在細胞質中堆積，導致Wnt/β-catenin信號通路活化，促進β-catenin進入細胞核，激活下游靶基因轉錄，從而調控細胞分化、周期、生長及遷移[14-16]。cyclin-D1、C-Myc和MMP-7為Wnt/β-catenin下游靶基因，在乳腺癌中過表達，cyclin-D1過表達可促進乳腺癌侵襲轉移，C-Myc過表達可促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，MMP-7過表達可促進腫瘤生長，增強細胞侵襲能力[17-19]。

miR-194可通過Wnt/β-catenin信號通路參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展，Peng等[20]研究發(fā)現(xiàn)miR-194通過Wnt/β-catenin信號通路參與胃癌發(fā)生發(fā)展，張楊等[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-194通過Wnt/β-catenin信號通路參與肝癌細胞增殖和侵襲。Wnt/β-catenin信號通路在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，miR-194可通過Wnt/β-catenin信號參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展，因此推測miR-194可能通過Wnt/β-catenin信號通路參與乳腺癌細胞增殖、侵襲遷移。本研究發(fā)現(xiàn)過表達miR-194可下調p-GSK-3β、β-catenin、cyclin-D1、C-Myc、MMP-7蛋白水平，表明miR-194可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路激活、下調其下游基因發(fā)揮抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移。

綜上所述，miR-194可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制乳腺癌發(fā)生發(fā)展，但本研究僅對人乳腺癌MCF-7細胞進行研究，miR-194在其他乳腺癌細胞株中的表達情況及其在動物實驗中的表達情況有待進一步研究。