曾慈梅 王 蕾 齊見旭

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院呼吸內(nèi)科，?？?570208)

隨著環(huán)境污染的日益嚴重，尤其近些年受霧霾的影響，肺癌已成為發(fā)病率(160萬/年)和死亡率(140萬/年)較高的常見惡性腫瘤[1]。其中非小細胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)占比高達85%，而肺腺癌又是NSCLC的主要類型之一[1]。多數(shù)腺癌起源于較小的支氣管，為周圍型肺癌，手術(shù)切除是早期病例的主要治療方法，治愈率較高[2]。然而大部分肺癌患者診斷時已經(jīng)處于中晚期，錯過了最佳手術(shù)時機，此時多采用放化療聯(lián)合的治療方案，并且隨著放射療法的不斷進步和完善，患者的存活期得以顯著延長[3]。但肺腺癌的放射敏感性較低，長時程電離輻射暴露癌細胞容易出現(xiàn)放療抵抗，故研究新型放療增敏劑以改善放療效果是長期以來的研究重點[4]。

紫甘藍是一種著名的十字花科蔬菜，國內(nèi)外對不同種類甘藍的研究表明，PCE含有較高的硫代葡萄糖苷(硫苷)和花青素，有較強的抗氧化作用[5,6]。一些研究表明，紫甘藍提取物(purple cabnbage extraet，PCE)所含的硫苷是一種具有抗癌特性的成分，對乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肝癌等多種癌癥均具有明顯的抑制作用[7,8]。然而關(guān)于PCE放射增敏的相關(guān)研究卻鮮見報道，故本研究以人肺腺癌細胞A549(人非小細胞肺癌)為研究對象，系統(tǒng)研究了PCE對A549細胞放射敏感性的影響并初步探索了其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 肺腺癌細胞A549購自中科院上海生命科學(xué)研究所；新鮮無變質(zhì)紫甘藍購自生鮮超市;DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司；RT-PCR試劑盒購自Thermo公司；蛋白裂解液購自美國Kaygen公司；BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；二抗購自美國CST公司；qRT-PCR實驗試劑盒購自TaqMan公司；細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；6 MV X線直線加速器購自德國西門子公司；流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司；酶標儀購自美國 Gibco公司。

1.2方法

1.2.1PCE的制備 取 500 g 紫甘藍洗凈晾干后，用榨汁機榨取汁液，2 000 r/min 離心20 min，取上清，于25℃恒溫箱內(nèi)靜置過夜后，用濾紙及0.22 μm微孔濾膜反復(fù)過濾，所得澄清液體即為紫甘藍原液。將其冷凍干燥24 h后得到凍干粉末，再溶解于蒸餾水中，制備成PCE。

1.2.2細胞培養(yǎng) 以含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺腺癌A549細胞，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2、飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，密切觀察細胞生長情況，3～4 d傳代一次，取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.3CCK-8檢測細胞活力 將A549細胞(4 000個/孔)接種在96孔板中，培養(yǎng)過夜。吸去培養(yǎng)基后，移液器將100 μl含有不同濃度PCE的DMEM高糖培養(yǎng)基(0、10、50、100、250、500 μmol/L)加入各對應(yīng)組板孔中，48 h后加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀測定450 nm波長處的吸光度(OD值)，按照以下公式計算細胞活力，擬合曲線計算IC50值:細胞活力(%)=(A加藥-A空白)/(A0加藥-A空白)×100%。其中，A加藥為實驗孔吸光度(含有細胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液和PCE溶液的吸光度)；A空白為空白孔吸光度(含有培養(yǎng)基和CCK-8溶液的吸光度)；A0加藥為對照孔吸光度(含有細胞、培養(yǎng)基和CCK-8溶液的孔的吸光度)。

細胞輻射毒性分析實驗亦采用CCK-8實驗，將對數(shù)生長期的A549細胞分為對照組(CON,A組)，10 μmol/L PCE組(PCE-10 μmol/L,B組)、50 μmol/L PCE組(PCE-50 μmol/L,C組)、照射組(IR,D組)、照射加10 μmol/L PCE組(IR+PCE-10 μmol/L,E組)、照射加50 μmol/L PCE組(IR+PCE-50 μmo/L,F組)。

1.2.4細胞凋亡實驗 將對數(shù)生長期的A549細胞在6孔板中(每孔1×105個/ml)接種，分組情況同1.2.3。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h后，以6 Gy的劑量進行照射。照射后24 h收集全部細胞于離心管內(nèi)，1 000 r/min 離心5 min，PBS洗滌后離心2次。隨后，在500 μl Binding Buffer中懸浮細胞，5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染色溶液加入混勻后在避光條件下室溫反應(yīng)15 min，流式細胞儀檢測，分析各組細胞凋亡率。

1.2.5miRNA qRT-PCR實驗 根據(jù)TaqMan miRNA ABC Purification試劑盒的說明，從不同濃度PCE培養(yǎng)的A549細胞中特異性提取miRNA。分光光度計檢測核酸濃度，以吸光度比(A260/A280)評估RNA純度，評估合格的RNA保存在-80℃?zhèn)溆?。以miRNA為模板，用TaqMan MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RT-PCR合成cDNA。以合成的cDNA為模板，用TaqMan?MicroRNA Assays試劑盒進行qPCR定量測量各組miRNA-326的含量。以RNU-6為miRNA-326的內(nèi)源對照，用Allele ID 6.0 軟件設(shè)計引物如表1所示。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.6Western blot實驗 收集細胞在蛋白裂解液中裂解30 min，超聲處理后4℃ 12 000 r/min離心15 min。通過BCA試劑盒定量測量蛋白濃度，使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離等量的蛋白質(zhì)，之后在4℃下進行300 mA恒流轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)。隨后將膜放入5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，在4℃下用Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9以及β-actin一抗孵育過夜，然后在溫室下加入二抗保持1 h，最后ECL顯影曝光檢測。

2 結(jié)果

2.1PCE對人肺腺癌細胞A549的抑制作用 不同濃度PCE對A549細胞的抑制率見表2，結(jié)果表明人肺腺癌細胞A549生長增殖在加入PCE作用后受到抑制，并且藥物的濃度越高，其增殖抑制率越高。通過曲線擬合函數(shù)計算可得其作用48 h后的IC50值為121.3 μmol/L(圖1)， 故本實驗選擇10 μmol/L和50 μmol/L作為后續(xù)放射增敏研究的藥物劑量。分組照射后結(jié)果顯示，PCE對A549細胞有放射增敏效果，且隨藥物濃度的增大，放射效果增強(P<0.05)，如圖2所示。

圖1 細胞活力-藥物濃度曲線Fig.1 Cell viability-concentration curveNote:IC50 was calculated to be 121.3 μmol/L by curve fitting the log values of cell viability and PCE concentration.

圖2 照射24 h后PCE對A549的細胞抑制Fig.2 Cellular inhibition of A549 with PCE after 24 h IRNote:*.P<0.05,**.P<0.01.

表2 不同濃度的PCE作用 48 h 對A549細胞抑制率

2.2PCE對照射后A549細胞凋亡的影響 通過Annexin-V/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測A549細胞在經(jīng)不同處理之后的凋亡水平變化。未照射組細胞凋亡水平相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3A～C，P>0.05)。照射后，單純照射組細胞凋亡率為7.63%±0.27%(圖3D)，加入10 μmol/L PCE照射后細胞凋亡率為9.62%±0.42%(圖3E)，加入50 μmol/L PCE照射后細胞凋亡率為17.50%± 0.37%(圖3F)。加入PCE組照射后細胞凋亡率明顯高于單純照射組(均P<0.000 1)，見圖3G。

2.3PCE對照射后A549細胞miRNA326表達的影響 通過qRT-PCR實驗檢測在不同濃度PCE作用下照射前后miRNA326的表達。相對于A組，B組、C組可上調(diào)miRNA326的表達(P<0.01);同時D組對比A組的 mRNA326 表達明顯下降(P<0.05)，而E、F組對比D組miRNA326的表達均有明顯上調(diào)(P<0.01)。結(jié)果表明，PCE可以上調(diào)照射后A549細胞miRNA326的表達，并且藥物濃度越高，上調(diào)越明顯。見圖4。

圖4 PCE提高了電離輻射誘導(dǎo)的A549的細胞凋亡Fig.4 Apoptosis was increased with PCE by IR in A549 cellsNote:Compared with Con group，*.P<0.05,**.P<0.01；compared with IR group，△.P<0.05,△△.P<0.01.

2.4PCE調(diào)節(jié)A549細胞中Bcl-2、Caspase-3及Caspase-9的表達水平 照射后給藥組Bcl-2的表達下降，而Caspase-3、Caspase-9的表達明顯加強，提示PCE激活了其線粒體凋亡通路，進一步說明了PCE能夠增強照射后A549細胞的凋亡水平，見圖5。

圖5 PCE調(diào)節(jié)A549細胞中Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達Fig.5 Protein expression of Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 was regulated with PCE in A549 cells

3 討論

本研究首先通過CCK-8實驗摸索了不同濃度PCE對A549細胞的作用規(guī)律，為后續(xù)研究提供了充分依據(jù)；再通過CCK-8實驗研究了PCE加藥對照射后細胞活力的影響，基本明確PCE對A549細胞放射敏感性良好的增敏效果；為初步探索其作用機制，本研究以流式細胞術(shù)結(jié)合Annexin V-PI雙染凋亡檢測技術(shù)評價PCE對A549細胞在照射后的凋亡率，發(fā)現(xiàn)其明顯增強了A549的細胞凋亡水平，而后續(xù)Western blot實驗結(jié)果顯示凋亡通路蛋白分子Bcl-2、Caspase-3以及Caspase-8的表達活化，再次印證了上述結(jié)果；同時，qRT-PCR結(jié)果顯示PCE顯著上調(diào)了A549在照射前后miRNA-326的轉(zhuǎn)錄水平，提示PCE對A549細胞的放射增敏作用是通過上調(diào)腫瘤抑制因子miRNA-326進而激活凋亡通路而發(fā)揮的。

迄今為止，miRNAs對基因表達的調(diào)控已得到了廣泛關(guān)注，其參與生命過程中一系列的重要進程，包括早期發(fā)育、細胞增殖、細胞凋亡、脂肪代謝和細胞分化等，同時大量研究也發(fā)現(xiàn)miRNAs和癌癥之間有潛在的關(guān)系[9-14]。而本研究中涉及的關(guān)鍵分子miRNA326的下調(diào)與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，如結(jié)直腸癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細胞瘤等[15-18]。本研究發(fā)現(xiàn)照射可導(dǎo)致A549細胞中miRNA326的下調(diào)，而PCE可抑制該作用，通過激活線粒體凋亡途徑從而抑制A549細胞的增殖并提高其凋亡率從而上調(diào)miRNA326水平，這與孫曹成等[19]的研究相一致。

凋亡是細胞照射的主要生理反應(yīng)之一，多種放射增敏劑是通過提高照射后細胞凋亡水平繼而達到放射增敏的功效[20]。本研究中，PCE通過提高miRNA326的水平，下調(diào)Bcl2，活化Caspase9繼而激活Caspase3，從而提高了A549的放射敏感性，具有極高的藥用價值。同時相關(guān)研究表明，PCE含有豐富的硫苷和花青素，有明顯的抗氧化作用，對多種癌癥具有預(yù)防效果，并且毒副作用低[21-25]。綜上，PCE有望成為新一代高效低毒的腫瘤輻射增敏劑。

然而由于藥物放射增敏作用機制十分復(fù)雜，PCE是否能通過其他分子通路起作用仍需深入研究。