曾慈梅 王 蕾 齊見(jiàn)旭

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院呼吸內(nèi)科，?？?570208)

隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，尤其近些年受霧霾的影響，肺癌已成為發(fā)病率(160萬(wàn)/年)和死亡率(140萬(wàn)/年)較高的常見(jiàn)惡性腫瘤[1]。其中非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)占比高達(dá)85%，而肺腺癌又是NSCLC的主要類(lèi)型之一[1]。多數(shù)腺癌起源于較小的支氣管，為周?chē)头伟?，手術(shù)切除是早期病例的主要治療方法，治愈率較高[2]。然而大部分肺癌患者診斷時(shí)已經(jīng)處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，此時(shí)多采用放化療聯(lián)合的治療方案，并且隨著放射療法的不斷進(jìn)步和完善，患者的存活期得以顯著延長(zhǎng)[3]。但肺腺癌的放射敏感性較低，長(zhǎng)時(shí)程電離輻射暴露癌細(xì)胞容易出現(xiàn)放療抵抗，故研究新型放療增敏劑以改善放療效果是長(zhǎng)期以來(lái)的研究重點(diǎn)[4]。

紫甘藍(lán)是一種著名的十字花科蔬菜，國(guó)內(nèi)外對(duì)不同種類(lèi)甘藍(lán)的研究表明，PCE含有較高的硫代葡萄糖苷(硫苷)和花青素，有較強(qiáng)的抗氧化作用[5,6]。一些研究表明，紫甘藍(lán)提取物(purple cabnbage extraet，PCE)所含的硫苷是一種具有抗癌特性的成分，對(duì)乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肝癌等多種癌癥均具有明顯的抑制作用[7,8]。然而關(guān)于PCE放射增敏的相關(guān)研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道，故本研究以人肺腺癌細(xì)胞A549(人非小細(xì)胞肺癌)為研究對(duì)象，系統(tǒng)研究了PCE對(duì)A549細(xì)胞放射敏感性的影響并初步探索了其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 肺腺癌細(xì)胞A549購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究所；新鮮無(wú)變質(zhì)紫甘藍(lán)購(gòu)自生鮮超市;DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自Thermo公司；蛋白裂解液購(gòu)自美國(guó)Kaygen公司；BCA試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司；qRT-PCR實(shí)驗(yàn)試劑盒購(gòu)自TaqMan公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；6 MV X線(xiàn)直線(xiàn)加速器購(gòu)自德國(guó)西門(mén)子公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó) Gibco公司。

1.2方法

1.2.1PCE的制備 取 500 g 紫甘藍(lán)洗凈晾干后，用榨汁機(jī)榨取汁液，2 000 r/min 離心20 min，取上清，于25℃恒溫箱內(nèi)靜置過(guò)夜后，用濾紙及0.22 μm微孔濾膜反復(fù)過(guò)濾，所得澄清液體即為紫甘藍(lán)原液。將其冷凍干燥24 h后得到凍干粉末，再溶解于蒸餾水中，制備成PCE。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 以含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2、飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，密切觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，3～4 d傳代一次，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 將A549細(xì)胞(4 000個(gè)/孔)接種在96孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜。吸去培養(yǎng)基后，移液器將100 μl含有不同濃度PCE的DMEM高糖培養(yǎng)基(0、10、50、100、250、500 μmol/L)加入各對(duì)應(yīng)組板孔中，48 h后加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD值)，按照以下公式計(jì)算細(xì)胞活力，擬合曲線(xiàn)計(jì)算IC50值:細(xì)胞活力(%)=(A加藥-A空白)/(A0加藥-A空白)×100%。其中，A加藥為實(shí)驗(yàn)孔吸光度(含有細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液和PCE溶液的吸光度)；A空白為空白孔吸光度(含有培養(yǎng)基和CCK-8溶液的吸光度)；A0加藥為對(duì)照孔吸光度(含有細(xì)胞、培養(yǎng)基和CCK-8溶液的孔的吸光度)。

細(xì)胞輻射毒性分析實(shí)驗(yàn)亦采用CCK-8實(shí)驗(yàn)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞分為對(duì)照組(CON,A組)，10 μmol/L PCE組(PCE-10 μmol/L,B組)、50 μmol/L PCE組(PCE-50 μmol/L,C組)、照射組(IR,D組)、照射加10 μmol/L PCE組(IR+PCE-10 μmol/L,E組)、照射加50 μmol/L PCE組(IR+PCE-50 μmo/L,F組)。

1.2.4細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞在6孔板中(每孔1×105個(gè)/ml)接種，分組情況同1.2.3。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h后，以6 Gy的劑量進(jìn)行照射。照射后24 h收集全部細(xì)胞于離心管內(nèi)，1 000 r/min 離心5 min，PBS洗滌后離心2次。隨后，在500 μl Binding Buffer中懸浮細(xì)胞，5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染色溶液加入混勻后在避光條件下室溫反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.5miRNA qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 根據(jù)TaqMan miRNA ABC Purification試劑盒的說(shuō)明，從不同濃度PCE培養(yǎng)的A549細(xì)胞中特異性提取miRNA。分光光度計(jì)檢測(cè)核酸濃度，以吸光度比(A260/A280)評(píng)估RNA純度，評(píng)估合格的RNA保存在-80℃?zhèn)溆?。以miRNA為模板，用TaqMan MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RT-PCR合成cDNA。以合成的cDNA為模板，用TaqMan?MicroRNA Assays試劑盒進(jìn)行qPCR定量測(cè)量各組miRNA-326的含量。以RNU-6為miRNA-326的內(nèi)源對(duì)照，用Allele ID 6.0 軟件設(shè)計(jì)引物如表1所示。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞在蛋白裂解液中裂解30 min，超聲處理后4℃ 12 000 r/min離心15 min。通過(guò)BCA試劑盒定量測(cè)量蛋白濃度，使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離等量的蛋白質(zhì)，之后在4℃下進(jìn)行300 mA恒流轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)。隨后將膜放入5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，在4℃下用Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9以及β-actin一抗孵育過(guò)夜，然后在溫室下加入二抗保持1 h，最后ECL顯影曝光檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1PCE對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549的抑制作用 不同濃度PCE對(duì)A549細(xì)胞的抑制率見(jiàn)表2，結(jié)果表明人肺腺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)增殖在加入PCE作用后受到抑制，并且藥物的濃度越高，其增殖抑制率越高。通過(guò)曲線(xiàn)擬合函數(shù)計(jì)算可得其作用48 h后的IC50值為121.3 μmol/L(圖1)， 故本實(shí)驗(yàn)選擇10 μmol/L和50 μmol/L作為后續(xù)放射增敏研究的藥物劑量。分組照射后結(jié)果顯示，PCE對(duì)A549細(xì)胞有放射增敏效果，且隨藥物濃度的增大，放射效果增強(qiáng)(P<0.05)，如圖2所示。

圖1 細(xì)胞活力-藥物濃度曲線(xiàn)Fig.1 Cell viability-concentration curveNote:IC50 was calculated to be 121.3 μmol/L by curve fitting the log values of cell viability and PCE concentration.

圖2 照射24 h后PCE對(duì)A549的細(xì)胞抑制Fig.2 Cellular inhibition of A549 with PCE after 24 h IRNote:*.P<0.05,**.P<0.01.

表2 不同濃度的PCE作用 48 h 對(duì)A549細(xì)胞抑制率

2.2PCE對(duì)照射后A549細(xì)胞凋亡的影響 通過(guò)Annexin-V/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞在經(jīng)不同處理之后的凋亡水平變化。未照射組細(xì)胞凋亡水平相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A～C，P>0.05)。照射后，單純照射組細(xì)胞凋亡率為7.63%±0.27%(圖3D)，加入10 μmol/L PCE照射后細(xì)胞凋亡率為9.62%±0.42%(圖3E)，加入50 μmol/L PCE照射后細(xì)胞凋亡率為17.50%± 0.37%(圖3F)。加入PCE組照射后細(xì)胞凋亡率明顯高于單純照射組(均P<0.000 1)，見(jiàn)圖3G。

2.3PCE對(duì)照射后A549細(xì)胞miRNA326表達(dá)的影響 通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在不同濃度PCE作用下照射前后miRNA326的表達(dá)。相對(duì)于A組，B組、C組可上調(diào)miRNA326的表達(dá)(P<0.01);同時(shí)D組對(duì)比A組的 mRNA326 表達(dá)明顯下降(P<0.05)，而E、F組對(duì)比D組miRNA326的表達(dá)均有明顯上調(diào)(P<0.01)。結(jié)果表明，PCE可以上調(diào)照射后A549細(xì)胞miRNA326的表達(dá)，并且藥物濃度越高，上調(diào)越明顯。見(jiàn)圖4。

圖4 PCE提高了電離輻射誘導(dǎo)的A549的細(xì)胞凋亡Fig.4 Apoptosis was increased with PCE by IR in A549 cellsNote:Compared with Con group，*.P<0.05,**.P<0.01；compared with IR group，△.P<0.05,△△.P<0.01.

2.4PCE調(diào)節(jié)A549細(xì)胞中Bcl-2、Caspase-3及Caspase-9的表達(dá)水平 照射后給藥組Bcl-2的表達(dá)下降，而Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)明顯加強(qiáng)，提示PCE激活了其線(xiàn)粒體凋亡通路，進(jìn)一步說(shuō)明了PCE能夠增強(qiáng)照射后A549細(xì)胞的凋亡水平，見(jiàn)圖5。

圖5 PCE調(diào)節(jié)A549細(xì)胞中Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達(dá)Fig.5 Protein expression of Bcl-2,Caspase-3 and Caspase-9 was regulated with PCE in A549 cells

3 討論

本研究首先通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)摸索了不同濃度PCE對(duì)A549細(xì)胞的作用規(guī)律，為后續(xù)研究提供了充分依據(jù)；再通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)研究了PCE加藥對(duì)照射后細(xì)胞活力的影響，基本明確PCE對(duì)A549細(xì)胞放射敏感性良好的增敏效果；為初步探索其作用機(jī)制，本研究以流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合Annexin V-PI雙染凋亡檢測(cè)技術(shù)評(píng)價(jià)PCE對(duì)A549細(xì)胞在照射后的凋亡率，發(fā)現(xiàn)其明顯增強(qiáng)了A549的細(xì)胞凋亡水平，而后續(xù)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示凋亡通路蛋白分子Bcl-2、Caspase-3以及Caspase-8的表達(dá)活化，再次印證了上述結(jié)果；同時(shí)，qRT-PCR結(jié)果顯示PCE顯著上調(diào)了A549在照射前后miRNA-326的轉(zhuǎn)錄水平，提示PCE對(duì)A549細(xì)胞的放射增敏作用是通過(guò)上調(diào)腫瘤抑制因子miRNA-326進(jìn)而激活凋亡通路而發(fā)揮的。

迄今為止，miRNAs對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控已得到了廣泛關(guān)注，其參與生命過(guò)程中一系列的重要進(jìn)程，包括早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、脂肪代謝和細(xì)胞分化等，同時(shí)大量研究也發(fā)現(xiàn)miRNAs和癌癥之間有潛在的關(guān)系[9-14]。而本研究中涉及的關(guān)鍵分子miRNA326的下調(diào)與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，如結(jié)直腸癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等[15-18]。本研究發(fā)現(xiàn)照射可導(dǎo)致A549細(xì)胞中miRNA326的下調(diào)，而PCE可抑制該作用，通過(guò)激活線(xiàn)粒體凋亡途徑從而抑制A549細(xì)胞的增殖并提高其凋亡率從而上調(diào)miRNA326水平，這與孫曹成等[19]的研究相一致。

凋亡是細(xì)胞照射的主要生理反應(yīng)之一，多種放射增敏劑是通過(guò)提高照射后細(xì)胞凋亡水平繼而達(dá)到放射增敏的功效[20]。本研究中，PCE通過(guò)提高miRNA326的水平，下調(diào)Bcl2，活化Caspase9繼而激活Caspase3，從而提高了A549的放射敏感性，具有極高的藥用價(jià)值。同時(shí)相關(guān)研究表明，PCE含有豐富的硫苷和花青素，有明顯的抗氧化作用，對(duì)多種癌癥具有預(yù)防效果，并且毒副作用低[21-25]。綜上，PCE有望成為新一代高效低毒的腫瘤輻射增敏劑。

然而由于藥物放射增敏作用機(jī)制十分復(fù)雜，PCE是否能通過(guò)其他分子通路起作用仍需深入研究。