魏雯麗，宮尾茂雄，吳正云，張文學，3*

（1.四川大學 輕工科學與工程學院，四川 成都 610065；2.東京家政大學 家政學部，日本 東京173-8602；3.四川大學錦江學院 白酒學院，四川 眉山 620860）

四川泡菜是我國傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的代表之一，目前，四川泡菜的生產模式由作坊式生產逐漸轉變?yōu)楣I(yè)化生產，工業(yè)泡菜多是用食鹽直接腌漬新鮮蔬菜而成，而豇豆泡菜有所不同，工業(yè)豇豆泡菜是通過泡菜母水泡制而成，且豇豆泡菜因其口感爽脆、咸酸可口、富含維生素C（vitamin C，VC）和氨基酸等特點深受消費者喜愛[1-2]。

泡菜的品質及獨特風味與微生物代謝密切相關，泡菜中微生物種類豐富，包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、片球菌屬（Pediococcus）和鏈球菌屬（Strep-tococcus）等[3-4]，而不同地域，蔬菜原料以及發(fā)酵工藝等對泡菜微生物菌群均有一定影響，目前已有的報道多是對不同地域成熟泡菜[5]和不同品種成熟泡菜[6]的對比研究，而針對不同工廠的泡菜在發(fā)酵過程中微生物的種類及動態(tài)變化的比較還較少。

近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，高通量測序技術已經廣泛用于發(fā)酵食品中微生物群落分析。王勇等[7]運用高通量測序技術分析了大曲的微生物多樣性；尚雪嬌等[8]通過高通量測序技術對梅干菜中細菌多樣性進行了研究。因此，本實驗利用高通量測序技術探究不同工廠豇豆泡菜發(fā)酵過程中的細菌群落結構及優(yōu)勢菌屬的動態(tài)變化規(guī)律，同時對其發(fā)酵過程中理化指標進行測定，比較不同工廠豇豆泡菜發(fā)酵過程中菌群和理化特性的異同，以期為優(yōu)化工業(yè)豇豆泡菜發(fā)酵過程，提高泡菜產品質量提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豇豆泡菜液樣品：采集自四川省眉山市J泡菜廠和W泡菜廠；氫氧化鈉（分析純）：成都科龍化工試劑廠；HiPure Stool脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）試劑盒：廣州Magen公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒：美國Axygen Biosciences公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C酸度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；WS202鹽度計：上海民儀電子有限公司；LC-2030高效液相色譜儀：日本島津公司；MyCyclerTMThermal Cycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Bio-Rad公司；DYY-5瓊脂糖凝膠電泳儀：中國北京市六一儀器廠；Legend Micro 17R高速冷凍離心機、ABI Step OnePlus實時熒光定量PCR：美國賽默飛公司；Illumina HiSeq 2500測序平臺：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜發(fā)酵工藝與樣品采集

J廠的發(fā)酵工藝為：將新鮮豇豆浸泡在含鹽量約為10%的泡菜母水中，用木棍壓實，在相對開放的環(huán)境中發(fā)酵。W廠采用含鹽量約15%的泡菜母水腌制新鮮豇豆，木棍壓實，最上層用沙石封住發(fā)酵池，在相對封閉的環(huán)境中進行發(fā)酵。采用四角取樣法采集樣品，3個月發(fā)酵期內，每15 d取樣一次，發(fā)酵時間90 d，取樣后冰袋運回實驗室置于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 理化指標分析檢測

采用pH計和鹽度計分別測定pH值和鹽度；參照國標GB/T 12456—2008《食品總酸的測定》[9]測定樣品中總酸含量。

采用高效液相色譜法測定有機酸含量。樣品處理：在4 ℃條件下以8 000×g離心10 min，上清液稀釋5倍，用0.22 μm水系濾膜過濾。高效液相色譜法測定色譜條件：色譜柱為Carbomix H-NP（7.8 mm×300 mm，5 μm），以0.25 mol/L H2SO4作為流動相，流速0.6 mL/min，柱溫55 ℃，進樣量10 μL。紫外檢測器波長210 nm，通過與標準品的保留時間和峰面積的比較，對其進行定性和定量。用SPSS 24.0進行統(tǒng)計分析，所有實驗均重復3次，結果用“平均值±標準差”表示。

1.3.3 DNA提取及測序

采用HiPure Stool DNA試劑盒提取樣品的DNA。引物341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'），806R（5'-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3'）擴增細菌16S rDNA V3-V4區(qū)。PCR擴增體系：5 μL 10×KOD緩沖液，1 μL KOD DNA聚合酶，5 μL脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmol/L），1.5 μL正反向引物（5 μmol/L），100 ng DNA模板。PCR擴增條件：95 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，循環(huán)27次，最后68 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒中純化回收PCR產物，用ABI Step OnePlus Real-Time PCR System進行檢測定量，送至廣州基迪奧生物公司進行測序，測序平臺為Illumina HiSeq 2500。

1.3.4 測序數(shù)據(jù)分析

對測序原始數(shù)據(jù)進行拼接和質控后獲得有效序列。利用UPARSE[10]軟件按97%相似度劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），并挑選代表序列。按核糖體數(shù)據(jù)庫項目（ribosomal database project，RDP）classifier 貝葉斯算法[11]將每個OTU代表序列與SILVA[12]數(shù)據(jù)庫比對，獲得細菌分類學注釋。用QIIME[13]計算Alpha多樣性，利用R軟件對細菌群落結構的相似性進行了基于OTUs的主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結果與分析

2.1 工業(yè)豇豆泡菜發(fā)酵過程的理化指標變化

總酸和pH值是衡量泡菜發(fā)酵的重要指標[14]。J廠和W廠豇豆泡菜發(fā)酵過程中理化指標變化見表1。由表1可知，發(fā)酵前15 d，兩家工廠豇豆發(fā)酵液pH值均迅速下降，隨后基本維持穩(wěn)定，J廠和W廠最終pH值分別為3.51和3.99；發(fā)酵前30 d，J廠總酸含量從1.78 g/kg顯著增加至9.96 g/kg，隨后逐漸下降至發(fā)酵90 d的8.01 g/kg，而W廠的總酸含量隨著發(fā)酵的進行從2.71 g/kg逐漸增加至5.57 g/kg。乳酸是豇豆泡菜主要的風味物質，與總酸的變化趨勢相似，J廠的乳酸的含量迅速增加到9.07 g/L，隨后逐漸下降至5.22 g/L，W廠的乳酸含量逐漸增加到4.65 g/L?？偟膩碚f，在整個發(fā)酵過程中兩廠的草酸含量均隨著發(fā)酵進行逐漸下降而乙酸含量明顯升高。隨著發(fā)酵進行，新鮮豇豆和泡菜母水中存在的乳酸菌等微生物生長代謝活躍，產生大量乳酸和乙酸使得總酸含量明顯增加，pH值快速下降，而J廠發(fā)酵30 d后乳酸和總酸含量下降是由于乳酸積累過量抑制了乳酸菌代謝，且乳酸被部分微生物消耗以克服乳酸脅迫作用。豇豆中的草酸會被微生物利用生成其他物質導致含量降低。鹽度是影響乳酸菌生長代謝的重要因素[15]，為防止腐敗，工業(yè)泡菜一般用高鹽腌制。W廠中的鹽度從17%逐漸下降至15.57%，鹽分隨著發(fā)酵時間的延長逐漸滲透進豇豆中使得泡菜液中的鹽度逐漸降低，而由于J廠未完全封池，水分蒸發(fā)從而使得鹽度從11.1%逐漸上升到13%。在整個發(fā)酵過程中W廠的鹽度始終高于J廠，而鹽度過高會抑制乳酸菌的代謝，鹽度較低，乳酸菌代謝更活躍，因此，J廠的總酸和乳酸含量高于W廠。

表1 工業(yè)豇豆泡菜發(fā)酵過程中理化指標變化Table 1 Changes of physicochemical indexes of industrial cowpea paocai during fermentation process

2.2 Alpha多樣性分析

J廠和W廠細菌OTU總數(shù)范圍分別為1 392～1 683、1 438～1 741，兩家工廠豇豆泡菜發(fā)酵過程中微生物群落的Alpha多樣性指數(shù)結果見表2。

表2 工業(yè)豇豆泡菜樣品中細菌Alpha多樣性指數(shù)分析Table 2 Analysis of bacterial Alpha diversity indexes of industrial cowpea paocai samples

由表2可知，發(fā)酵前期W廠的OTU數(shù)高于J廠，這是由于兩廠泡菜母水微生物組成的差異引起的，而隨著發(fā)酵的進行，兩廠泡菜液中的菌群逐漸變得相似，到發(fā)酵結束時OTU數(shù)相差較小。所有樣品的Good's Coverage指數(shù)均為0.99，說明樣品文庫中序列的覆蓋率高，本次測序可反映泡菜發(fā)酵過程中菌群組成的真實情況。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)可衡量物種豐度，Shannon 指數(shù)可衡量物種多樣性和均勻度[16]。J廠發(fā)酵第1天的Chao1和ACE指數(shù)在整個發(fā)酵過程中最小，隨后波動上升，而W廠發(fā)酵第1天的Chao1和ACE指數(shù)最大且高于J廠，隨后波動下降，表明W廠在發(fā)酵第1天細菌群落豐富度最高，經過發(fā)酵作用菌群豐富度有所降低，而J廠在發(fā)酵第1天細菌群落豐富度最低，經過發(fā)酵作用菌群豐富度上升，發(fā)酵90 d時，兩廠的Chao1和ACE指數(shù)相近。與Chao1和ACE指數(shù)趨勢類似，J廠Shannon指數(shù)值波動上升而W廠波動下降，但發(fā)酵90 d后兩廠的Shannon指數(shù)值相差較小。

2.3 細菌群落多樣性

基于門水平及屬水平上工業(yè)豇豆泡菜樣品中細菌群落結構見圖1。由圖1A可知，在門水平上，J廠發(fā)酵第1天，變形菌門（Proteobacteria，77.22%）是絕對優(yōu)勢菌門，隨后，變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度下降而厚壁菌門（Firmicutes）（66%～91%）主導了整個發(fā)酵過程，而厚壁菌門（Firmicutes）在W廠的整個發(fā)酵過程中一直是絕對優(yōu)勢菌門，其相對豐度為71%～88%。由圖1B可知，在屬水平上，變形菌門的弧菌屬（Vibrio）以61.27%的相對豐度主導J廠發(fā)酵第1天，然后迅速下降至1%以下。而弧菌屬（Vibrio）在W廠發(fā)酵第1天相對豐度僅占4%，這是泡菜母水和新鮮豇豆表面的弧菌的含量差異導致的。發(fā)酵第1天，J廠僅有3%的乳桿菌屬（Lactobacillus）被檢出，發(fā)酵第15天，其相對豐度迅速上升至56.24%，成為優(yōu)勢菌屬，隨著發(fā)酵的進行波動上升至發(fā)酵90 d的74%，主導著J廠的發(fā)酵過程直至發(fā)酵結束。而在W廠的發(fā)酵過程中，乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度從55%逐漸增加至發(fā)酵45 d時的76%，隨后波動下降至73%，乳桿菌屬（Lactobacillus）始終是絕對優(yōu)勢菌屬。這與以往對家庭泡菜和榨菜的研究一致[17-18]。乳桿菌屬（Lactobacillus）在發(fā)酵第15～30天迅速增加，代謝產生大量乳酸和乙酸，在此期間兩廠豇豆泡菜pH迅速下降且總酸迅速上升。

圖1 門水平（A）及屬水平（B）上工業(yè)豇豆泡菜樣品中細菌群落結構Fig.1 Bacterial community structure of industrial cowpea paocai samples based on phylum (A) and genus (B) level

總的來說，W廠中乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度始終高于J廠，這是由于初始泡菜母水和豇豆中乳桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度差異導致的，但與W廠相比，J廠中乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度增加更顯著，推測W廠中的高鹽度抑制了乳桿菌屬（Lactobacillus）的生長代謝，從而在整個發(fā)酵過程中，J廠的乳酸、總酸、pH變化幅度也較W廠的變化幅度更大。魏斯氏菌屬（Weissella）（12.36%～16.53%）和片球菌屬（Pediococcus）（10.2%～28.35%）分別是J廠發(fā)酵第1～30天和第45～60天的第二優(yōu)勢菌屬，但魏斯氏菌屬（Weissella）和片球菌屬（Pediococcus）的相對豐度隨后迅速下降，在發(fā)酵90 d時分別為0.47%和6.7%，與J廠一樣，魏斯氏菌屬（Weissella）在W廠發(fā)酵第1～30天也是主要菌屬，其相對豐度為10.50%～22.95%，隨后迅速下降至1.5%，但片球菌屬（Pediococcus）在W廠發(fā)酵過程中并不是主要菌屬，在W廠發(fā)酵第60～90天中，Terasakiispira（7%～10%）是主要菌屬之一，但其在J廠發(fā)酵后期幾乎未被檢出，有關Terasakiispira的報道較少，在豇豆泡菜中的作用有待進一步分析。魏斯氏菌屬（Weissella）是腌制類發(fā)酵食品中重要的微生物之一，可代謝生成乳酸、乙酸、短鏈脂肪酸和胞外多糖，對泡菜的風味和營養(yǎng)有重要貢獻[19-20]，在兩廠發(fā)酵前中期均檢測到相對較高的魏斯氏菌屬而隨后開始下降，魏斯氏菌屬可能是工業(yè)豇豆泡菜發(fā)酵啟動菌。另外，在兩廠發(fā)酵過程中，由于高鹽環(huán)境，還檢測到了色鹽桿菌屬（Chromohalobacter）、鹽單胞菌屬（Halomonas）和鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）等嗜鹽菌屬，但色鹽桿菌屬（Chromohalobacter）是J廠中的主要嗜鹽菌屬而W廠中主要是鹽單胞菌屬（Halomonas），這是可能是由于兩者鹽度差異造成的。在兩廠發(fā)酵前中期還檢測到少量會導致腐敗的假單胞菌屬（Pseudomonas），可能來源于新鮮豇豆和陳年泡菜母水，但發(fā)酵結束時均未檢測到。整體而言，由于發(fā)酵初期泡菜母水中的微生物群落不同以及發(fā)酵條件的不同，兩廠發(fā)酵過程中微生物組成存在一定差異，但隨著發(fā)酵進行，乳桿菌屬（Lactobacillus）都是豇豆泡菜發(fā)酵中后期的絕對優(yōu)勢菌。

2.4 細菌群落結構相似性分析

采用PCA對J廠和W廠發(fā)酵過程中的細菌群落結構的相似性進行分析，結果見圖2。由圖2可知，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的方差貢獻率分別為60.35%和19.97%，兩個主要成分能夠解釋80.32%的細菌OTU差異。J1和W1距離較遠，表明兩廠在發(fā)酵第1天細菌群落結構有較大差異，兩廠發(fā)酵15 d和30 d的樣品各自聚在一起，說明發(fā)酵15 d和30 d的細菌群落組成較為相似，但兩廠之間在此發(fā)酵階段仍有較大差異，發(fā)酵45～90 d的樣品相距較近，且兩廠在此階段的樣品距離也較近，表明發(fā)酵45～90 d的細菌群落較為相似并且兩廠在發(fā)酵后期的細菌群落組成較為相似。隨著發(fā)酵時間的延長，乳桿菌屬（Lactobacillus）逐漸成為絕對優(yōu)勢菌屬，豇豆泡菜液中細菌組成逐漸趨于穩(wěn)定，樣品中細菌群落結構相似性逐漸增加。

圖2 工業(yè)豇豆泡菜樣品中細菌群落結構主成分分析Fig.2 Principal component analysis of bacterial community structure of industrial cowpea paocai samples

3 結論

以豇豆泡菜為研究對象，通過高通量測序技術探究了兩個不同工廠豇豆泡菜發(fā)酵過程中細菌多樣性，其中，弧菌屬（Vibrio）和魏斯氏菌屬（Weissella）主導了J廠發(fā)酵第1天而乳桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella）是W廠發(fā)酵第1 天的主要菌屬，但隨著發(fā)酵進行，發(fā)酵15 d后，乳桿菌屬（Lactobacillus）在兩家工廠均成為絕對優(yōu)勢菌屬直至發(fā)酵結束。另外，對豇豆泡菜發(fā)酵過程中的理化變化也進行了分析，總體而言，兩家工廠豇豆泡菜的pH和草酸含量降低而總酸、乳酸和乙酸含量顯著增加，J廠的鹽度低于W廠，總酸和乳酸含量高于W廠?？紤]到鹽度對豇豆泡菜中乳桿菌屬（Lactobacillus）的生長代謝有一定影響，進而影響乳酸等主要泡菜風味物質的形成，并且長期食用高鹽食品容易引發(fā)健康問題，所以工廠可根據(jù)自身情況適當調整發(fā)酵用鹽量。本研究探究了工業(yè)豇豆泡菜在不同發(fā)酵過程中細菌群落變化和理化指標變化規(guī)律，以期有助于優(yōu)化工業(yè)泡菜發(fā)酵工藝。