狄春光，王慧，王功發(fā)，王毅，華科，王麗萍

(浙江省嘉興市婦幼保健院生殖中心，嘉興 314000)

卵母細(xì)胞體外成熟(in vitro maturation，IVM)是一項(xiàng)新的輔助生殖技術(shù)，可用于難治性多囊卵巢綜合征(PCOS)患者和促排卵周期中卵巢反應(yīng)不良患者不成熟卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)成熟，目前國(guó)內(nèi)外IVM技術(shù)并不是很成熟。有研究表明IVM后的卵母細(xì)胞紡錘體結(jié)構(gòu)和染色體構(gòu)型異常比例要高于正常胚胎[1]，因此如何在IVM胚胎中篩選出正常且發(fā)育潛能高的胚胎，是臨床上亟待解決的問(wèn)題。目前的胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估只能在固定的時(shí)間點(diǎn)對(duì)胚胎進(jìn)行觀察[2]，不能對(duì)影響胚胎發(fā)育潛能的非正常事件，如非二倍性卵裂等進(jìn)行觀察評(píng)估，故胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估在不同發(fā)育潛能的胚胎篩選上有一定局限性[3]。而時(shí)差成像系統(tǒng)(time-lapse imaging，TLI)為非侵入性胚胎評(píng)估系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)中的胚胎進(jìn)行連續(xù)觀察，獲得與胚胎發(fā)育相關(guān)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，從而準(zhǔn)確評(píng)估其發(fā)育潛能[4-5]，是對(duì)胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估的一個(gè)有力補(bǔ)充。因此本研究利用TLI結(jié)合胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估方法建立一種新的IVM胚胎篩選模式，以期為臨床實(shí)踐中挑選高發(fā)育潛能的胚胎移植提供參考，以提高患者臨床妊娠率。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2016年2月至2019年5月于本中心接受IVF/ICSI-ET助孕治療患者的402枚未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行IVM培養(yǎng)。卵母細(xì)胞IVM后行ICSI授精，精子來(lái)源均為患者丈夫，受精后的胚胎在TLI系統(tǒng)中觀察培養(yǎng)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并艾滋病、梅毒、乙型肝炎抗原陽(yáng)性患者。本研究通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查，所有患者夫妻雙方已簽署知情同意書。

二、研究方法

1.IVM培養(yǎng)液準(zhǔn)備：G-2 plus胚胎培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)，含有0.2 μg/ml 17β-雌二醇(Sigma，美國(guó))、75 U/L FSH和150 U/L HCG(Serono，瑞士)。

2.未成熟卵母細(xì)胞的收集及培養(yǎng)：所有患者從上一月經(jīng)周期排卵后7 d或月經(jīng)第2天開始注射達(dá)菲林(Ipsen，法國(guó))針劑0. 1 mg/d，降調(diào)節(jié)至少14 d后檢查性激素水平，達(dá)降調(diào)水平，開始注射果納芬(Serono，瑞士)或麗申寶(珠海麗珠制藥)進(jìn)行控制性促排卵，至雙側(cè)卵巢內(nèi)有2個(gè)或2個(gè)以上的卵泡直徑達(dá) 18 mm時(shí)，注射重組HCG 250μg(Serono，瑞士)，36 h后在陰道超聲引導(dǎo)下取卵。ICSI前剝除卵母細(xì)胞周圍的大部分顆粒細(xì)胞，經(jīng)倒置顯微鏡觀察卵母細(xì)胞的成熟程度，選擇未成熟卵母細(xì)胞(GV期或MI期)供本研究使用。將未成熟卵母細(xì)胞移入IVM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24～40 h，如果卵母細(xì)胞成熟則行ICSI受精，受精卵在TLI系統(tǒng)中培養(yǎng)。

3.TLI系統(tǒng)使用及胚胎培養(yǎng)：使用Primo Vision(Vitrolife，瑞典)TLI系統(tǒng)，圖像每5 min采集1次，共連續(xù)培養(yǎng)6 d。所有胚胎均采用WOW 9孔培養(yǎng)皿，卵裂期胚胎培養(yǎng)液為37℃、6%CO2平衡過(guò)夜的G-1 plus(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)液。囊胚培養(yǎng)為37℃、6%CO2平衡過(guò)夜的G-2 plus(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)液，培養(yǎng)過(guò)程中均有Primo Vision成像系統(tǒng)采集圖像，并進(jìn)行胚胎發(fā)育的動(dòng)力學(xué)參數(shù)與卵裂模式分析。

4.胚胎發(fā)育時(shí)間參數(shù)和卵裂模式設(shè)定：胚胎發(fā)育各時(shí)間點(diǎn)的命名方法參照Ciray標(biāo)準(zhǔn)[6]，將ICSI受精時(shí)間記為“0”點(diǎn)，原核消失時(shí)間(tPNF)，發(fā)育至2細(xì)胞時(shí)間為t2，發(fā)育至3細(xì)胞時(shí)間為t3，以此類推為t4、t5。2細(xì)胞發(fā)育至3細(xì)胞所需時(shí)間為cc2，3細(xì)胞發(fā)育至4細(xì)胞所需時(shí)間為s2，比較第3天(D3)IVM胚胎未形成囊胚組(A組)和形成囊胚組(B組)相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。胚胎的卵裂模式包括正常卵裂、非軸性卵裂、不均、卵裂球碎裂、非二倍性卵裂、發(fā)育停滯等。

5.胚胎評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：卵裂期胚胎評(píng)估參考Peter標(biāo)準(zhǔn)[7]，囊胚期胚胎評(píng)估參考Gardner標(biāo)準(zhǔn)[8]。D3可移植胚胎：細(xì)胞數(shù)≥4個(gè)，碎片≤30%，胚胎內(nèi)無(wú)異常結(jié)構(gòu)；D3優(yōu)選胚胎：細(xì)胞數(shù)7～12個(gè)，碎片≤20%；D3次選胚胎：D3可移植胚胎中優(yōu)選胚胎除外的胚胎。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)tPNF、t2、t3、t4、t5、cc2、s2等計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，以中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q25，Q75)]表示，組間比較用非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。對(duì)非二倍性卵裂發(fā)生率、囊胚形成率等計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估選擇發(fā)育潛能更高的IVM胚胎

本研究共納入402枚未成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行IVM培養(yǎng)，共有315枚成熟，成熟率為78.4%；對(duì)315枚IVM成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行ICSI后，正常受精219枚，形成D3可移植胚胎數(shù)162枚。按胚胎形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估，在D3獲得優(yōu)選胚胎95枚，次選胚胎67枚。優(yōu)選胚胎和次選胚胎的囊胚形成率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 兩組囊胚形成率比較(%)

二、IVM胚胎卵裂模式與囊胚形成的關(guān)系

通過(guò)TLI觀察，我們發(fā)現(xiàn)在219枚受精卵中非二倍性卵裂的發(fā)生率最高(24.2%)，其后分別為正常卵裂(21.9%)、不均(17.8%)、發(fā)育停滯(16.9%)、非軸性卵裂(10.1%)、卵裂球碎裂(9.1%)。IVM胚胎中正常卵裂胚胎的囊胚形成能力最高(52.1%)，其次是非軸性卵裂胚胎(45.5%)，再次為分裂不均胚胎(35.9%)，卵裂球碎裂最低(10.0%)，發(fā)育停滯和非二倍性卵裂胚胎均無(wú)囊胚形成(表2)。

表2 IVM胚胎中各卵裂模式的發(fā)生率和囊胚形成率(n=219，%)

三、動(dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)IVM胚胎發(fā)育潛能的預(yù)測(cè)性

D3 IVM胚胎未形成囊胚組(A組，111枚)和形成囊胚組(B組，51枚)相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩組動(dòng)力學(xué)參數(shù)tPNF、t2、t3、cc2、s2比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，t4、t5比較有顯著性差異(P<0.05)(表3)，提示t4、t5對(duì)IVM胚胎的發(fā)育潛能具有一定預(yù)測(cè)性。B組t4、t5的參數(shù)值范圍分別為(24.6～41.9)h和(26.1～56.9)h，該范圍內(nèi)的IVM胚胎具有更高的囊胚形成能力。

表3 兩組動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較[M(Q25，Q75)，h]

四、TLI結(jié)合胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估建立IVM胚胎篩選模式

首先在D3 IVM胚胎中排除發(fā)生非二倍性卵裂的胚胎，非二倍性卵裂胚胎為廢棄胚胎(即E級(jí)胚胎)。然后再按胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估將IVM胚胎分為可移植胚胎和廢棄胚胎，繼續(xù)將可移植胚胎分為優(yōu)選胚胎和次選胚胎，結(jié)合形成囊胚最佳的t4、t5動(dòng)力學(xué)參數(shù)范圍，再篩選出A、B、C、D四級(jí)胚胎。A級(jí)胚胎符合優(yōu)選胚胎標(biāo)準(zhǔn)，且胚胎t4、t5動(dòng)力學(xué)參數(shù)均在最佳范圍內(nèi)；B級(jí)胚胎符合優(yōu)選胚胎標(biāo)準(zhǔn)，胚胎t4、t5動(dòng)力學(xué)參數(shù)不在最佳范圍內(nèi)；C級(jí)胚胎符合次選胚胎標(biāo)準(zhǔn)，胚胎t4、t5動(dòng)力學(xué)參數(shù)均在最佳范圍內(nèi)；D級(jí)胚胎符合次選胚胎標(biāo)準(zhǔn)，胚胎t4、t5動(dòng)力學(xué)參數(shù)不在最佳范圍內(nèi)。胚胎移植或冷凍優(yōu)先級(jí)為A>B>C>D(圖1)。

圖1 IVM胚胎篩選模式

五、驗(yàn)證篩選模式下所選胚胎的囊胚形成能力

再次收集123枚未成熟卵細(xì)胞，經(jīng)IVM成熟92枚，受精后得到D3可移植胚胎43枚。在所建立的篩選模式下篩選出A級(jí)胚胎14枚、B級(jí)胚胎11枚、C級(jí)胚胎8枚、D級(jí)胚胎10枚，繼續(xù)囊胚培養(yǎng)，結(jié)果優(yōu)選胚胎囊胚形成率44.0%。該模式下各級(jí)胚胎的囊胚形成率如下：A(64.3%)>B(18.2%)>C(12.5%)>D(10.0%)。該模式所選出的A級(jí)胚胎囊胚形成率顯著高于優(yōu)選胚胎(64.3% vs. 44.0%)(P<0.05)，證實(shí)該篩選模式在IVM胚胎高發(fā)育潛能胚胎的篩選中有較高的應(yīng)用價(jià)值。

討 論

如何快速有效地挑選高發(fā)育潛能的IVM胚胎，一直是臨床上亟待解決的問(wèn)題。本研究中我們利用TLI系統(tǒng)結(jié)合卵裂期胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估，建立了有效準(zhǔn)確的IVM胚胎篩選模式，有利于優(yōu)化篩選胚胎流程，快速挑選出高發(fā)育潛能的胚胎進(jìn)行移植，經(jīng)篩選后的A級(jí)胚胎囊胚形成率為64.3%，遠(yuǎn)高于胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估所得優(yōu)選胚胎的囊胚形成率44.0%，具有非常大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

胚胎發(fā)育過(guò)程中，一些非正常事件的發(fā)生，如非二倍性卵裂、不均、發(fā)育停滯、非軸性卵裂、卵裂球碎裂等，都可能預(yù)示著胚胎未來(lái)的命運(yùn)[9]。非正常事件中不均、發(fā)育停滯可以通過(guò)在D1、D2、D3等固定時(shí)間點(diǎn)對(duì)胚胎進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察對(duì)照發(fā)現(xiàn)，而非二倍性卵裂、非軸性卵裂和卵裂球碎裂則很難被傳統(tǒng)胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估方法發(fā)現(xiàn)，TLI技術(shù)對(duì)胚胎不間斷地連續(xù)觀察，可獲取胚胎發(fā)育全過(guò)程的動(dòng)態(tài)影像，能對(duì)胚胎發(fā)育進(jìn)行更加全面和細(xì)致的記錄[10]，因此非軸性卵裂、非二倍性卵裂、卵裂球碎裂可在TLI觀察下迅速被發(fā)現(xiàn)。本研究中非軸性卵裂、卵裂球碎裂等胚胎均有囊胚形成，而非二倍體卵裂胚胎的囊胚形成率為0%，并且非二倍性卵裂發(fā)生率最高(24.2%)，因此我們認(rèn)為在IVM胚胎篩選中應(yīng)首先剔除非二倍性卵裂胚胎。王珊珊等[11]報(bào)道非二倍性卵裂胚胎的優(yōu)質(zhì)囊胚形成率僅為2.16%。Athayde等[12]報(bào)道非二倍性卵裂胚胎的囊胚形成率為11.7%，種植率只有3.7%，建議非二倍性卵裂作為胚胎篩選的排除條件。因此，本研究中我們建立的IVM胚胎篩選模式中首要的排除條件為非二倍性卵裂胚胎。

目前已有很多研究將TLI技術(shù)運(yùn)用到胚胎篩選評(píng)估中，主要通過(guò)胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)胚胎發(fā)育潛能進(jìn)行預(yù)測(cè)[13-15]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)t4形成囊胚的最佳范圍為(24.6～41.9)h，當(dāng)t4>41.9 h時(shí)囊胚形成能力下降。Yang等[16]利用TLI系統(tǒng)研究其動(dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)138枚受精卵發(fā)育成囊胚的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)t4>41.3 h時(shí)，胚胎形成囊胚能力下降。與我們的結(jié)果相似，也從側(cè)面證實(shí)參數(shù)t4的重要性。t5同樣可以作為胚胎發(fā)育潛能的預(yù)測(cè)性參數(shù)，Meseguer等[15]對(duì)285例ICSI周期患者胚胎的卵裂時(shí)間、卵裂球大小和多核等做了詳細(xì)的回顧性分析，總共移植了522枚胚胎，結(jié)果顯示當(dāng)t5最佳范圍為(48.8～56.6)h時(shí)，其胚胎種植率約40%，遠(yuǎn)高于其范圍之外的種植率。本研究中我們確定的t5最佳范圍為(26.1～56.9)h，比Meseguer等[15]的確定范圍略大，分析其原因可能為各中心的促排卵方案、培養(yǎng)環(huán)境及人員操作等差異造成了各中心提取的共性參數(shù)有所不同。因此，各生殖中心應(yīng)該根據(jù)最適合本中心的共性參數(shù)，挑選優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植。

胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估雖然有一定局限性，但其挑選的正常優(yōu)質(zhì)胚胎的囊胚形成率依然可達(dá)60%以上，且效率遠(yuǎn)高于TLI，依然是各大實(shí)驗(yàn)室胚胎評(píng)估的主要方法。而TLI雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但考慮到價(jià)格因素，每臺(tái)TLI系統(tǒng)加上配套耗材估計(jì)使用價(jià)格達(dá)百萬(wàn)元以上，因此現(xiàn)階段大規(guī)模的TLI應(yīng)用還不現(xiàn)實(shí)，但對(duì)于反復(fù)移植失敗、高齡、需IVM等特殊患者的應(yīng)用，能提高TLI的使用價(jià)值。尤其使用TLI結(jié)合胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估對(duì)胚胎進(jìn)行篩選，可使篩選高發(fā)育潛能胚胎的效果得到提高[17-18]。對(duì)反復(fù)移植失敗、高齡、需IVM等患者而言，其胚胎染色體異常的概率遠(yuǎn)大于正常患者，利用TLI結(jié)合胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估方法從中篩選高發(fā)育潛能的胚胎，可以顯著提高這些患者的妊娠率。本研究中我們進(jìn)行IVM培養(yǎng)的不成熟卵母細(xì)胞是當(dāng)患者的優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)18 mm時(shí)經(jīng)過(guò)取卵后獲得，患者所獲得的卵母細(xì)胞大部分已成熟，不成熟卵母細(xì)胞只占小部分，患者有足夠正常成熟卵母細(xì)胞來(lái)源的胚胎移植，因此IVM胚胎的臨床應(yīng)用價(jià)值仍然具有一定局限性[19]。而在臨床上經(jīng)典的IVM促排方案中，當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑達(dá)10 mm～12 mm時(shí)，超聲引導(dǎo)下經(jīng)取卵術(shù)獲得的卵母細(xì)胞均不成熟，經(jīng)IVM培養(yǎng)后才能成熟，并具有受精形成胚胎的能力。因此臨床上經(jīng)典的IVM促排方案對(duì)因卵泡發(fā)育遲緩影響卵母細(xì)胞成熟的不孕患者來(lái)說(shuō)意義重大。利用TLI結(jié)合形態(tài)學(xué)評(píng)估方法建立的這種針對(duì)IVM胚胎的篩選模式，對(duì)經(jīng)典IVM促排方案來(lái)源的IVM胚胎篩選，具有極高的借鑒和應(yīng)用價(jià)值。