張釧，周秉博，張慶華，王興，郝勝菊，陳雪，李富萍，劉亞利，劉青，馬旭，曹宗富*

(1.國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；3. 甘肅省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)中心，蘭州 730050)

耳聾是人類最常見(jiàn)的感覺(jué)缺陷之一，耳聾在新生兒中的發(fā)病率約為1/1 000[1-2]。約有50%～60%的耳聾是由遺傳因素引起的[3]。耳聾的遺傳方式有常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳、線粒體遺傳及X/Y連鎖遺傳。目前已經(jīng)有超過(guò)110多個(gè)基因被報(bào)道與耳聾相關(guān)[4]。流行病學(xué)研究表明GJB2、SLC26A4和12SrRNA是遺傳性耳聾最常見(jiàn)的致病基因[2]。耳聾的遺傳學(xué)診斷非常重要，它可以為患者家庭提供治療決策、預(yù)后信息和遺傳咨詢。本研究采用耳聾基因芯片、Sanger測(cè)序法及高通量測(cè)序Pannel法，對(duì)在甘肅省婦幼保健院遺傳中心就診的354個(gè)耳聾高危兒及39個(gè)耳聾患者家系進(jìn)行耳聾基因診斷分析，并為這些家庭提供遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2015年5月至2019年12月在甘肅省婦幼保健院遺傳中心就診的354例漢族耳聾高危兒患者及39例漢族耳聾患者家系的臨床資料。本研究經(jīng)甘肅省婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[2016院倫審研第(4)號(hào)]，血樣的采集及臨床資料的收集征得所有家系成員的同意，并簽署知情同意書(shū)。

二、基因組DNA提取

采集耳聾高危兒足跟血干血斑，其父母抽取外周血2～3 ml；耳聾患者及其父母抽取外周血2～3 ml。干血斑及外周血基因組DNA分別按照干血斑基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)與血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。耳聾患者家庭的先證者母親再孕時(shí)，于孕18～21周經(jīng)腹行羊膜腔穿刺，抽取羊水15 ml。按羊水細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行模板DNA的提取，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、耳聾基因芯片檢測(cè)

使用晶芯十五項(xiàng)遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測(cè)試劑盒(北京博奧晶典)檢測(cè)GJB2基因c.35delG、c.176_191del16、c.235delC及c.299_300delAT 4個(gè)位點(diǎn)；GJB3基因c.538C>T 1個(gè)位點(diǎn)；SLC26A4基因c.2168A>G、IVS7-2A>G、c.1174A>T、c.1226G>A、c.1229C>T、c.1975G>C、c.2027T>A及IVS15+5G>A 8個(gè)位點(diǎn)；線粒體12SrRNA基因chrM-1494C>T及chrM-1555A>G 2個(gè)位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增條件：37℃ 10 min，95℃ 15 min，95℃ 30 s，57℃ 30 s，70℃ 45 s，35 cycles；60℃ 10 min，12℃暫停。芯片雜交：50℃水浴1 h。掃描判讀：結(jié)果由晶芯十五項(xiàng)遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測(cè)分析系統(tǒng)自動(dòng)判讀。當(dāng)探針的檢測(cè)信號(hào)值大于或等于該探針位點(diǎn)的cut off值時(shí)，判斷該探針為陽(yáng)性；當(dāng)探針的檢測(cè)信號(hào)值小于該探針的cut off值時(shí)，判斷該探針為陰性。

四、GJB2及12S rRNA基因突變分析

基因外顯子擴(kuò)增引物由上海生工公司合成。PCR擴(kuò)增體系為25 μl：其中2×Taq PCR Mastermix(北京天根生化科技有限公司)12.5 μl，基因組DNA模版1.5 μl(濃度20～50 ng/μl)，上下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μl，ddH2O 10 μl。PCR引物及擴(kuò)增條件見(jiàn)表1，由于GJB2擴(kuò)增產(chǎn)物較長(zhǎng)，除了正反向測(cè)序外，同時(shí)使用兩條測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，兩條測(cè)序引物(5’-3’)分別為：TGGGTTTTGATCTC-CTCGATG，GCCTACCGGAGACATGAGAAG。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂電泳鑒定后對(duì)目的條帶單一的產(chǎn)物采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)純化后，由ABI 3500型(ABI，美國(guó))測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用SeqMan軟件與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定GJB2及12SrRNA是否存在突變。

表1 引物序列、產(chǎn)物大小及擴(kuò)增條件

五、高通量測(cè)序Pannel分析

耳聾患者經(jīng)GJB2及12SrRNA基因突變分析后，仍未明確突變者，采用高通量測(cè)序Pannel法(北京邁基諾基因科技股份有限公司)進(jìn)行耳聾相關(guān)基因檢測(cè)以明確致病突變，測(cè)序平均深度為200×，大于20×的靶向reads達(dá)到97%以上。

六、數(shù)據(jù)分析

高通量測(cè)序得到的結(jié)果與參考基因組(GRCh37/hg19)比對(duì)得到所有變異的文件，對(duì)檢測(cè)到的堿基變異進(jìn)行篩選，應(yīng)用PolyPhen2(http：∥genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和 MutationTaster(http：∥www.mutationtaster.org/)軟件對(duì)新變異進(jìn)行蛋白功能預(yù)測(cè)，新變異致病性判讀依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)2015指南[5]。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示。

結(jié) 果

一、耳聾高危兒基因芯片檢測(cè)

晶芯十五項(xiàng)基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，354例漢族耳聾高危兒中，316例高危兒未檢測(cè)到突變，有21例檢測(cè)到了GJB2基因突變，其中17例高危兒檢測(cè)到GJB2雜合突變，2例高危兒檢測(cè)到GJB2復(fù)合雜合突變，2例高危兒檢測(cè)到GJB2純合突變；有16例患者檢測(cè)到了SLC26A4突變，其中11例高危兒檢測(cè)到SLC26A4雜合突變，1例高危兒檢測(cè)到SLC26A4復(fù)合雜合突變，4例高危兒檢測(cè)到SLC26A4純合突變；1例患者檢測(cè)到12SrRNA均質(zhì)突變。

GJB2突變中，突變頻率最高的位點(diǎn)是c.235delC，其次為c.299_300delAT；SLC26A4突變中，突變頻率最高的位點(diǎn)是c.919-2A>G(IVS7-2A>G)，其次為c.1174A>T與c.2168A>G(表2)。

二、耳聾患者Sanger測(cè)序和高通量Pannel測(cè)序

Sanger測(cè)序及高通量Pannel測(cè)序發(fā)現(xiàn)，39例漢族耳聾患者中，有13例檢測(cè)到了GJB2基因突變，其中9例檢測(cè)到復(fù)合雜合突變，2例檢測(cè)到純合突變，2例僅檢測(cè)到雜合突變；有15例患者檢測(cè)到了SLC26A4突變，其中8例檢測(cè)到復(fù)合雜合突變，5例檢測(cè)到純合突變，2例檢測(cè)到雜合突變；10例患者檢測(cè)到12SrRNA均質(zhì)突變；1例患者檢測(cè)到LOXHD1復(fù)合雜合突變。

GJB2突變中，突變頻率最高的位點(diǎn)是c.235delC，其次為c.299_300delAT及c.109G>A；SLC26A4突變中，突變頻率最高的位點(diǎn)是c.919-2A>G(IVS7-2A>G)，其次為c.1174A>T、c.2162C>T、c.410C>T和IVS15+5G>A(表2)。

表2 耳聾高危兒及耳聾患者耳聾基因致病位點(diǎn)分布

三、耳聾患者家系產(chǎn)前診斷分析結(jié)果

39例漢族耳聾患者家系中，有6例先證者明確診斷的家系在再次妊娠時(shí)進(jìn)行了遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷。6例胎兒中，有3例檢測(cè)到了與先證者相同的致病突變，2例胎兒僅檢測(cè)到1個(gè)致病突變，1例胎兒未檢測(cè)到與先證者相同的致病突變(表3)。

表3 耳聾家系產(chǎn)前診斷結(jié)果

討 論

遺傳性耳聾的致病基因受遺傳背景影響，在不同地區(qū)、不同人種中耳聾致病基因及其突變頻率存在明顯的差異；在中國(guó)，GJB2、GJB3、SLC26A4及12SrRNA是遺傳性耳聾的主要致病基因[6]。在本研究的39例漢族耳聾患者中，GJB2突變檢出率為33.3%、SLC26A4突變檢出率為38.5%、12SrRNA突變檢出率為25.6%，高于國(guó)內(nèi)新疆和福建地區(qū)報(bào)道的耳聾患者這三個(gè)基因的攜帶頻率[7-8]。在本研究中，GJB2(c.235delC)位點(diǎn)及SLC26A4(c.919-2A>G)是最主要的突變位點(diǎn)，這與多個(gè)地區(qū)的文獻(xiàn)報(bào)道[6，9-11]相一致。

我國(guó)已經(jīng)普及了新生兒的聽(tīng)力篩查，有效降低了出生缺陷，但由于超過(guò)50%～60%的耳聾是由遺傳因素造成，僅進(jìn)行聽(tīng)力篩查不僅無(wú)法明確病因還會(huì)漏掉遲發(fā)性耳聾的檢出。本研究中，354例耳聾高危兒中有38例(10.7%)檢測(cè)到了耳聾基因突變，其中9例(2.54%)確診為耳聾患者，1例為母系遺傳藥物性耳聾的易感個(gè)體。目前，國(guó)內(nèi)多個(gè)省份地區(qū)已經(jīng)開(kāi)展了聽(tīng)力篩查+耳聾基因篩查的模式，有效提升新生兒異常檢出率，可以更好地進(jìn)行耳聾防治干預(yù)[12-14]。對(duì)新生兒進(jìn)行耳聾基因篩查能及早發(fā)現(xiàn)母系遺傳藥物性耳聾的易感個(gè)體，通過(guò)用藥指導(dǎo)可有效避免因藥物導(dǎo)致的耳聾[15]。然而，目前國(guó)內(nèi)新生兒的耳聾基因篩查只是在一些發(fā)達(dá)省份及地區(qū)普遍開(kāi)展，在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)的西部省份還有待進(jìn)一步推行新生兒耳聾基因篩查。

多種方法可以進(jìn)行遺傳性耳聾的基因診斷，包括基因芯片法、Sanger測(cè)序法、高通量測(cè)序Pannel法及全外顯子組測(cè)序法等。臨床上主要使用的是基因芯片法、Sanger測(cè)序法和高通量測(cè)序Pannel法。目前新生兒耳聾基因篩查主要使用的是耳聾基因芯片法，該方法雖然涵蓋了GJB2、GJB3、SLC26A4及12SrRNA這4個(gè)耳聾基因，但是僅包含了少量的熱點(diǎn)突變。近年來(lái)，高通量測(cè)序Pannel法和全外顯子組測(cè)序法逐漸成為遺傳性耳聾基因診斷的重要工具，可以發(fā)現(xiàn)一些罕見(jiàn)性的耳聾致病突變基因。

對(duì)新生兒進(jìn)行耳聾基因篩查是預(yù)防耳聾的三級(jí)措施，對(duì)于生育過(guò)耳聾患者的家庭來(lái)說(shuō)，明確致病基因及位點(diǎn)后，孕期進(jìn)行產(chǎn)前診斷可以明確胎兒的基因型，從而有效避免患病胎兒的出生[16-17]。本研究對(duì)在甘肅省婦幼保健院診斷的39個(gè)耳聾患者家庭中的6個(gè)家庭進(jìn)行了產(chǎn)前診斷，明確了胎兒的基因型，為這些家庭進(jìn)行了生育指導(dǎo)。

本研究通過(guò)對(duì)354例耳聾高危兒進(jìn)行耳聾基因檢測(cè)，說(shuō)明在新生兒中進(jìn)行耳聾篩查+耳聾基因篩查的模式可以提高異常致病耳聾基因檢出率，盡早地進(jìn)行耳聾防治干預(yù)。高通量測(cè)序法可以提高耳聾致病基因的檢出率，并且可以發(fā)現(xiàn)罕見(jiàn)的耳聾致病突變基因。通過(guò)對(duì)耳聾患者家系先證者進(jìn)行耳聾基因產(chǎn)前診斷，可為這些家庭提供遺傳咨詢并進(jìn)行生育指導(dǎo)，可以有效降低這些家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。