付金劍，李夢(mèng)玥，胡音，王歡,2，周五朵,2，李平華,2，吳承武,2，杜陶然,2，蒲廣,2，黃瑞華,2*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)豬研究所,江蘇 南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)淮安研究院,江蘇 淮安 223001)

隨著國(guó)家“綠色”發(fā)展理念的提出和飼用抗生素逐漸被禁用，豬健康尤其是仔豬的腸道健康面臨著很大挑戰(zhàn)，高熱量、高蛋白的飼料配方不能滿足目前的需要[1]。日糧纖維(diary fiber，DF)能夠影響腸道環(huán)境，為腸道健康提供有利條件，但不同的飼料中DF有很大的差異，對(duì)腸道的影響也不相同[2]。我國(guó)小麥產(chǎn)量居世界前列，其加工成面粉的過程中產(chǎn)生了大量副產(chǎn)品麩皮有待開發(fā)利用。麩皮中含有豐富的DF，這些DF不能被小腸的內(nèi)源性水解酶水解，但可以在大腸中微生物的作用下被分解[3]。微生物發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFA)能夠被宿主腸道細(xì)胞作為能源吸收，并改善腸道菌群，腸道菌群的變化與豬健康密切相關(guān)[4-5]。已有大量研究表明，DF能夠顯著影響腸道微生物的組成和功能，提高抵抗病原菌腸道感染的能力，并促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的增殖，提高機(jī)體免疫力[6-7]。腸道黏膜是阻止各種病原微生物與毒素從腸道進(jìn)入機(jī)體的重要屏障結(jié)構(gòu)，腸道黏膜細(xì)胞增殖與凋亡變化會(huì)影響豬的機(jī)體健康。因此，研究麩皮的潛在利用價(jià)值，不僅能減少飼料成本，還能提高豬的健康水平，減少抗生素的使用，具有重要的實(shí)際意義。

二花臉豬是我國(guó)的地方豬種，與國(guó)外引進(jìn)的瘦肉型豬種相比，除了具有產(chǎn)仔率高、母性好、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)良的種質(zhì)遺傳特性，還具有較強(qiáng)的高纖維日糧耐受能力[8]。但有關(guān)不同纖維水平對(duì)其大腸腸道細(xì)胞增殖與凋亡基因的表達(dá)和腸道微生物的影響未知。

本試驗(yàn)旨在研究日糧麩皮替代水平對(duì)二花臉豬大腸腸道細(xì)胞增殖與凋亡基因表達(dá)和微生物的影響，為合理應(yīng)用麩皮等高日糧纖維飼料原料，降低養(yǎng)殖成本，提高豬健康水平提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇體重(38.25±0.89)kg二花臉育肥閹公豬20頭作為試驗(yàn)動(dòng)物，購(gòu)于常州市焦溪二花臉豬專業(yè)合作社。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)過程在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)淮安研究院試驗(yàn)豬場(chǎng)完成，將試驗(yàn)豬隨機(jī)分成4個(gè)處理組，利用自動(dòng)飼喂系統(tǒng)飼喂，可以準(zhǔn)確提供每頭豬的日采食量與個(gè)體體重，因此每頭豬認(rèn)定為1個(gè)重復(fù)，每組5個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)期間自由采食和飲水。整個(gè)過程預(yù)飼期10 d，正試期28 d。預(yù)飼期所有豬飼喂相同基礎(chǔ)日糧，正試期開始后設(shè)4個(gè)纖維水平處理組，分別飼喂基礎(chǔ)日糧、7%麩皮替代基礎(chǔ)日糧、14%麩皮替代基礎(chǔ)日糧和21%麩皮替代基礎(chǔ)日糧。所有試驗(yàn)豬飼養(yǎng)在同一個(gè)豬舍內(nèi)，每個(gè)欄大小為5.25 m×2.50 m，豬圈由半漏糞的地板、空氣源熱泵、奧斯本自動(dòng)飼喂站和節(jié)水型飲水碗組成，豬舍內(nèi)的環(huán)境溫度通過空氣源熱泵保持穩(wěn)定。

1.3 試驗(yàn)日糧

基礎(chǔ)日糧配制參考中國(guó)《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 65—2004)》肉脂型生長(zhǎng)肥育豬標(biāo)準(zhǔn)制定，飼料委托安佑生物科技集團(tuán)股份有限公司進(jìn)行訂制生產(chǎn)。日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平具體信息見表1。

表1 日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平

1.4 樣品采集

所有試驗(yàn)豬按照規(guī)范流程運(yùn)送至淮安蘇食肉品有限公司現(xiàn)代化屠宰場(chǎng)經(jīng)檢疫進(jìn)行屠宰分割。所有豬只按照應(yīng)激最小化原則電擊致暈、放血后，流水線上打開腹腔，取出完整胃腸道，分離出大腸。分別在盲腸和結(jié)腸中部截取約4 cm腸段，用生理鹽水浸泡去除內(nèi)容物，用無菌載玻片刮取腸道黏膜，裝至2 mL高壓滅菌過的凍存管中，迅速放入液氮中保存，實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存。其中結(jié)腸黏膜用于腸道細(xì)胞增殖、凋亡基因表達(dá)的定量分析，盲腸黏膜用于腸道微生物分析。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 結(jié)腸細(xì)胞增殖、凋亡基因表達(dá)量測(cè)定

TRIzol法提取黏膜RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，符合質(zhì)量要求的RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme，南京)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器進(jìn)行定量分析，使用20 μL體系(Vazyme，南京)，體系內(nèi)各成分如下：EvaGreen 2× qPCR MasterMix 10 μL，上下引物各0.6 μL，雙蒸水6.8 μL，DNA模板2 μL，每個(gè)樣品重復(fù)3次。其中引物序列信息見表2。

表2 結(jié)腸細(xì)胞凋亡與增殖基因引物序列信息

1.5.2 盲腸黏膜菌群16S rRNA基因拷貝數(shù)測(cè)定

使用Fast DNA SPIN Kit for Soil試劑盒提取微生物總DNA，由南京擎科生物科技有限公司合成引物，引物序列信息見表3。通過PCR擴(kuò)增和1.2%瓊脂凝膠電泳進(jìn)行各引物的驗(yàn)證，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)條件如下：1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，上下引物各1 μL，雙蒸水1 μL。驗(yàn)證后的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化回收 PCR 產(chǎn)物，制備重組質(zhì)粒細(xì)菌并做同源性分析?？寺〕晒筇崛≈亟M質(zhì)粒DNA并進(jìn)行梯度稀釋用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，利用熒光定量PCR儀對(duì)樣品中相關(guān)細(xì)菌16S rRNA拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系為：TB Green PremixExTaqⅡ 10 μL，上下引物各0.8 μL，雙蒸水6.4 μL，DNA模板2 μL。

表3 盲腸黏膜菌群實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理后，微生物16S rRNA基因拷貝數(shù)取以10為底的對(duì)數(shù)后參與統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。若P<0.05則表示其差異顯著，若0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧纖維水平對(duì)二花臉豬結(jié)腸細(xì)胞增殖與凋亡基因表達(dá)量的影響

由表4可見，在第28天，與對(duì)照組相比，14%日糧麩皮替代水平顯著提高了二花臉豬結(jié)腸Bcl-2L1基因表達(dá)量(P<0.05)。日糧麩皮替代水平對(duì)二花臉豬結(jié)腸Bax和Capase3基因表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)。

表4 日糧纖維水平對(duì)二花臉豬結(jié)腸細(xì)胞增殖與凋亡基因表達(dá)量的影響(n=5)

2.2 日糧纖維水平對(duì)二花臉豬盲腸黏膜菌群16S rRNA基因拷貝數(shù)的影響

由表5可見，在第28天，日糧麩皮替代水平對(duì)二花臉豬盲腸總菌、大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌16S rRNA基因拷貝數(shù)無顯著影響(P>0.05)。

表5 日糧纖維水平對(duì)二花臉豬盲腸黏膜菌群16S rRNA基因拷貝數(shù)的影響

3 討論

3.1 日糧纖維水平對(duì)二花臉豬結(jié)腸細(xì)胞增殖與凋亡基因表達(dá)量的影響

腸道黏膜是阻止各種病原微生物與毒素從腸道進(jìn)入機(jī)體的重要屏障結(jié)構(gòu)，腸黏膜屏障由物理、免疫、化學(xué)與生物屏障構(gòu)成，其中物理屏障是最基礎(chǔ)的防御結(jié)構(gòu)，由排列緊密的黏膜上皮細(xì)胞組成，腸黏膜上皮細(xì)胞主要發(fā)揮的是分泌與吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能[15-16]。健康的機(jī)體腸道上皮細(xì)胞維持著增殖與凋亡的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，如果凋亡基因表達(dá)失調(diào)，使大量黏膜細(xì)胞程序性死亡，將會(huì)導(dǎo)致機(jī)體腸道出現(xiàn)病理變化[17]。Caspase3被認(rèn)為是最重要的凋亡執(zhí)行體，其激活是不可逆凋亡的標(biāo)志。Bcl-2蛋白家族在調(diào)控細(xì)胞凋亡中起著重要作用，Bcl-2L1是一個(gè)抗凋亡基因，Bax是一個(gè)促凋亡基因，兩者在細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用。李超等[18]研究表明，Bcl-2L1的表達(dá)增多表示細(xì)胞的抗凋亡基因在大量表達(dá)，Bax與Caspase3的表達(dá)增多是凋亡增加的表現(xiàn)。

Jin等[19]研究發(fā)現(xiàn)提高日糧纖維水平對(duì)豬腸道上皮細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)對(duì)結(jié)腸細(xì)胞增殖與凋亡基因(Bcl-2L1、Bax、Caspase3)的表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定，在14%麩皮替代水平時(shí)，發(fā)現(xiàn)抗凋亡基因(Bcl-2L1)的表達(dá)量顯著上升，而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因(Bax、Caspase3)表達(dá)量對(duì)纖維日糧的替代沒有響應(yīng)。此結(jié)果說明14%麩皮替代水平抑制腸道細(xì)胞凋亡，與Jin等[19]結(jié)果相同。但也有一些研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果不同。Macrae等[20]研究發(fā)現(xiàn)提高日糧纖維含量對(duì)腸道上皮細(xì)胞的增殖并無影響。這可能是由于纖維的來源與粒度的差異造成的。

3.2 日糧纖維水平對(duì)二花臉豬盲腸黏膜菌群16S rRNA基因拷貝數(shù)的影響

前人的研究表明日糧纖維有促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)的作用，還對(duì)有害菌的生長(zhǎng)有抑制作用[21]。腸道中的微生物可將日糧中的纖維分解發(fā)酵，最終生成一些SCFA，如乙酸、丙酸、丁酸等。這些SCFA不僅可以通過降低pH來達(dá)到減少外來菌種的定值與生長(zhǎng)，還有研究表明乙酸在雙歧桿菌抑制病原微生物定值中發(fā)揮作用，丁酸可抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)[22]。張永婧等[23]研究發(fā)現(xiàn)小麥麩皮組中豬回腸末端食靡乳酸桿菌16S rRNA基因拷貝數(shù)增加。Gerritsen等[24]發(fā)現(xiàn)日糧中添加麩皮與燕麥殼可降低仔豬回腸與結(jié)腸中大腸桿菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)。Jiao等[25]發(fā)現(xiàn)在仔豬日糧中添加纖維寡糖可調(diào)節(jié)雙歧桿菌與乳酸桿菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)，并能降低致病菌如大腸桿菌、豬鏈球菌的16S rRNA基因拷貝數(shù)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明日糧麩皮替代水平對(duì)結(jié)腸雙歧桿菌、大腸桿菌、乳酸桿菌16S rRNA基因拷貝數(shù)無影響，與Yan等[26]研究結(jié)果一致，表明日糧纖維的增加并未破壞二花臉豬的腸道微生物環(huán)境，二花臉豬腸道微生物能夠耐受高纖維日糧。與其他一些研究結(jié)果不同的原因可能是試驗(yàn)動(dòng)物日齡的不同，日糧纖維的理化性質(zhì)、腸道部位、攝入時(shí)間的不同，有待進(jìn)一步研究。此外，由于本研究?jī)H開展了雙歧桿菌、大腸桿菌、乳酸桿菌幾種微生物的定量檢測(cè)，未來還有待繼續(xù)開展其他種類微生物的研究，尤其是利用組學(xué)技術(shù)進(jìn)行深入研究。