王彩紋，劉珍瓊，賈楓，羅海，晏亮

（江西省胸科醫(yī)院檢驗科，南昌 330006）

耐多藥肺結(jié)核(MDR-TB) 是指肺結(jié)核病患者所排出的結(jié)核桿菌至少對異煙肼與利福平藥物均產(chǎn)生耐藥性的一種肺結(jié)核病[1,2]。 2017 年3 月-20 19 年11 月，我們以在我院治療的53 例MDR 為實驗組 （A 組）， 同期將首次發(fā)現(xiàn)痰抗酸桿菌檢測陽性，其他相關(guān)條件同實驗組的80 例患者為對照組（B 組）。 定期對二組患者的外周血T 細(xì)胞的CD3值、CD4 值及 CD4/CD8 比值進(jìn)行監(jiān)測并進(jìn)行統(tǒng)計分析， 以探討T 細(xì)胞亞群狀況對耐多藥肺結(jié)核病情監(jiān)測的意義。

1 資料與方法

1.1 研究病例 研究對象為2017 年3 月-2019 年11 月在我院治療的53 例耐多藥肺結(jié)核患者（A組），平均年齡 (46.5±18.3)歲，其中男 36 例，女 17例 ， 病程 16 個月-19 年；26 例 耐 HR，18 例 耐HRS，9 例耐 HRSE。 入組標(biāo)準(zhǔn)：患者無自身免疫系統(tǒng)疾病， 無糖尿病，HIV 抗體初篩陰性， ALT、AST正常， 且近期未連續(xù)使用過糖皮質(zhì)激素的首次痰培養(yǎng)顯示耐多藥的病人。

1.2 對照病例 同期首次發(fā)現(xiàn)痰檢結(jié)核桿菌陽性且無耐藥史80 例為對照組 （B 組）， 平均年齡(39.5±26.8)歲，其中男 51 例，女 29 例，病程 1 個月-3年。入組標(biāo)準(zhǔn)除無耐藥情況外，其余均與A 組同。X線檢查顯示：31 例呈纖維空洞灶，49 例呈浸潤滲出型病灶灶。 兩組患者的性別、年齡無顯著性差異(P＞0.05)。

1.3 主要儀器及試劑 流式細(xì)胞儀為貝克曼庫爾特 Cytomics FC 500，試劑鼠抗人 CD45-SSC、CD3-PerCP、CD8-APC、CD4-FITC，F(xiàn)ACS 細(xì)胞破膜劑和FACS 細(xì)胞溶血素均購自Beckman 公司。

1.4 方法

1.4.1 兩組患者的抗結(jié)核治療方案 A 組每日藥物組合應(yīng)用：(1)帕斯煙肼 0.6g；(2)0 丙硫異煙胺 0.6g；(3)吡嗪酰胺 1.5g；(4)丁胺卡那霉素 0.4g；(5)左氧氟沙星0.6g，每日堅持用藥，持續(xù)2 個月；B 組先予每日異煙肼0.3g；利福平 0.45g；吡嗪酰胺0.5g；乙胺丁醇0.75g 殺菌與抑菌藥聯(lián)合同期強(qiáng)化治療2 個月， 后再視療效繼續(xù)予異煙肼0.3g； 利福平0.45g鞏固治療4 個月。

1.4.2 標(biāo)本的收集 清晨采集患者空腹靜脈血2ml于紫色75mm 的EDTA 抗凝管中，輕柔顛倒混勻。2.3 檢測方法 對兩組患者均分別于治療前后相同時抽取外周血， 標(biāo)本采集后2h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特Cytomics FC 500)進(jìn)行 CD3+、CD4+及CD8+淋巴細(xì)胞數(shù)量檢測。 實驗過程：對照管和測定管分別加入相應(yīng)患者的抗凝全血100μl，再依次加入抗人CD3-PerCP、CD8-APC 熒光單克隆抗體 10μl， 混勻后室溫避光反應(yīng) 15min 后加 入FACS1：10 稀釋溶血劑2ml， 輕柔混勻后再次室溫并于暗室避光反應(yīng)15min。 普通離心機(jī)3000r/min離心5min 后棄去上清液。 加入含疊氮鈉的無菌磷酸鹽緩沖液2ml， 洗滌后加入 1：10 稀釋的FACS破膜劑各 500μl， 再次室溫并于暗室避光反應(yīng)15min， 再次加入含疊氮鈉的無菌磷酸鹽緩沖液2ml,混勻，3000 r／min 離心 5min 后棄上清。用 50ml無菌磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞， 利用流式細(xì)胞儀檢測分析。以CD45-SSC 選定 CD3 細(xì)胞 ，為A 門，以A 設(shè)門，CD3-PerCP、CD8-APC 作圖選定 CD4 細(xì)胞，為 A2 門。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15.0 軟件對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理，兩樣本均數(shù)用x 示，比較選擇用t檢驗，P＜0.05 為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 實驗開始時兩組患者單位體積內(nèi)CD8 淋巴細(xì)胞相比較，無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。A 組所有患者經(jīng)2 個月抗結(jié)核系統(tǒng)的強(qiáng)化治療后， 有48 例患者病情好轉(zhuǎn)，癥狀也顯著改善，有39 例患者痰菌快速培養(yǎng)顯示轉(zhuǎn)陰， 其中38 例患者復(fù)查后顯示，其CD3+、CD4+及 CD4+/CD8+與治療前比較， 上升明顯(P＜0.05)，另 5 例患者出現(xiàn)病灶增多，且 CD3+、CD4+及CD4+/CD8+較前均降低。 見表1。

表1 治療前MDR-TB 組及初診菌陽組T 淋巴細(xì)胞亞群（個/μl）

2.2 B 組患者經(jīng)2 個月系統(tǒng)的抗結(jié)核強(qiáng)化治療后，其中76 例患者病情好轉(zhuǎn)，癥狀也顯著改善，且71例患者連續(xù)三次痰抗酸染色找結(jié)核桿菌均顯示陰性，69 例患者復(fù)查后顯示，其CD3+、CD4+及CD4+/CD8+比值與入組時比較，上升明顯(P0.05)，另 4 例患者臨床癥狀改善不明顯,且拍片顯示空洞范圍有擴(kuò)大， 但發(fā)熱癥狀消失， 且CD3+、CD4+及CD4+/CD8+比值較前無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05), 見表2。

表2 治療后MDR-TB 組及初診菌陽組T 淋巴細(xì)胞亞群（個/μl）

2.3 A、B 組療效分析實驗數(shù)據(jù)表明 經(jīng)過治療，療效顯著A、B 組患者單位外周血中的CD3+、CD4+、CD8+個數(shù)均有明顯增加，且CD4+/CD8+也有升高(P＜0.05)， 而療效不明顯的患者 CD3+、CD4+及CD4+/CD8+ 比值較前無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測設(shè)門結(jié)果(如圖1、圖2)

圖1 CD45-ssc 選取圖

圖2 CD4 CD8 分選圖

3 討論

耐多藥肺結(jié)核（MDR-TB）因?qū)εR床常用藥異煙肼與利福平藥物均有耐藥性,須依靠痰結(jié)核桿菌培養(yǎng)后作藥敏試驗才能確診，且因生長緩慢，周期耗時長，臨床治療難度較大[3,4]。 MDR-TB 大多因結(jié)核病治療期間的用藥不規(guī)則引起,根據(jù)世界衛(wèi)生組織與國際防癆及肺部疾病聯(lián)合會的最新調(diào)查數(shù)據(jù)，在新發(fā)病肺結(jié)核人群中，約10%的人群至少對一種藥物耐藥,至少約1%為耐多藥肺結(jié)核病人；而在復(fù)治病人中,將近7%的病人為耐多藥患者[5,6]。

T 淋巴細(xì)胞在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著不可或缺的作用，其各亞群數(shù)量、比例以及功能如果出現(xiàn)異常,均會使機(jī)體的免疫系統(tǒng)紊亂而導(dǎo)致發(fā)病[6]。本研究數(shù)據(jù)顯示，MDR-TB 患者經(jīng)過二個月的治療后，二組的外周血的 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+變化有著較明顯的差值。在MDR-TB 組，隨著患者病情穩(wěn)定，外周血中CD3+、CD4+及CD4+ /CD8+數(shù)值均有明顯的升高， 而5 例病灶增多的患者卻出現(xiàn)CD4+及CD4+ /CD8+下降，對照療效，考慮因耐藥情況，所選治療藥物不敏感，予做結(jié)核菌培養(yǎng)加藥敏實驗，但患者培養(yǎng)實驗為陰性無法做藥敏實驗，醫(yī)生已經(jīng)決定改變治療方案。 對照組在二個月治療后，在癥狀明顯改善的患者中，有69 例外周血檢測顯示CD3+、CD4+及CD4+ /CD8+數(shù)據(jù)顯著上升。 另空洞范圍有擴(kuò)大的4 例患者雖然發(fā)熱癥狀消失， 但 CD3+、CD4+及 CD4+ /CD8+ 比值較前無統(tǒng)計學(xué)差異 (P＞0.05)。 有研究報道，MDR-TB 患者CD8+的細(xì)胞毒性較初診肺結(jié)核患者作用增加明顯，且調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的表達(dá)增強(qiáng)[7,8]。

T 細(xì)胞亞群對評估機(jī)體免疫平衡狀態(tài)和整體的免疫能力,有著很好的臨床應(yīng)用性。 研究證實患者抗結(jié)核的免疫能力主要依靠 C D4 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)巨噬細(xì)胞而進(jìn)行相應(yīng)的免疫反應(yīng)， 這種模式與其他感染性疾病中所產(chǎn)生的的細(xì)胞免疫作用相比較相似度較高， 均為因感染反應(yīng)刺激結(jié)核分枝桿菌的耐藥性能夠影響結(jié)核病患者體內(nèi)的免疫狀態(tài)[10]。雖然部分免疫細(xì)胞的表達(dá)沒有發(fā)生改變,但是我們推測其免疫功能可能發(fā)生了改變,這有待于后面進(jìn)一步的研究證實[11]。 并且在CD4 所介導(dǎo)的抗結(jié)核免疫反應(yīng)當(dāng)中，CD8 抑制性作用也和CD4 所介導(dǎo)的反應(yīng)同時顯現(xiàn)，既能溶解已經(jīng)吞噬結(jié)核菌的巨噬細(xì)胞，引起結(jié)核桿菌的釋放，并引發(fā)宿主細(xì)胞的溶解破壞，并對組織構(gòu)成危害[12,13]。此外，部分結(jié)核桿菌還能藏匿于宿主內(nèi)的某些隱蔽細(xì)胞中,亦不能被免疫系統(tǒng)完全清除。鑒于此,有研究認(rèn)為，結(jié)核分枝桿菌的耐藥性能夠影響結(jié)核病患者體內(nèi)的免疫,雖然部分免疫細(xì)胞的表達(dá)沒有發(fā)生改變[14]。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)耐多藥結(jié)核病患者與普通肺結(jié)核患者治療前后外周血中的免疫細(xì)胞的單位數(shù)量及比例均發(fā)現(xiàn)變化， 但其中相關(guān)細(xì)胞的免疫狀態(tài)的還需要進(jìn)一步探究， 這對闡明耐多藥結(jié)核病的相應(yīng)免疫發(fā)病機(jī)制及進(jìn)行相應(yīng)免疫干預(yù)提供了實驗依據(jù)。