張健強

（江西省德興市人民醫(yī)院外一科，德興 334200）

蒲公英作為一種中藥已經(jīng)被廣泛使用， 其根部也被認為具有抗菌消炎、消腫止痛等功效[1]。 植物多酚已被證實具有多種功效，經(jīng)過研究開發(fā)，已有部分多酚物質(zhì)被應用在制藥行業(yè)[2]。 大腦是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的核心，受損后對人體意識、行動、生理活動都有直接影響， 嚴重的情況下還將危及生命[3]。 同時，機體的氧化應激平衡被打破出現(xiàn)氧化應激失衡，將加劇組織損傷[4]。 本研究探究多酚對腦損傷小鼠認知的恢復作用及氧化應激失衡的抑制作用， 為蒲公英根多酚的進一步應用探索新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 蒲公英根，杭州聚修堂健康科技有限公司；SOD、CAT、MDA 試劑盒，南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白測定盒，天根生化科技有限公司，SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠、PVDF 膜，美國Invitrogen 公司;一抗(SOD1、ab13498,CAT、ab76110,cAMP Protein Kinase Catalytic subunit、ab76238，p-CREB、ab32096)、二 抗 （ab6728）， 美 國 Abcam 公司；其余化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物 8 周齡雄性 SPF 級 C57BL/c 小鼠40 只（體重22-25g），江西中醫(yī)藥大學實驗動物科技中心。

1.3 儀器與設(shè)備 用顱腦打擊器，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；BW-MWM101morris 水迷宮，上海軟隆科技發(fā)展有限公司；LUX 多功能性酶標儀，美國賽默飛公司；LAS3000 成像系統(tǒng)，日本富士公司。

1.4 方法

1.4.1 小鼠腦損傷模型 將蒲公英根冷凍干燥后粉碎，然后按文獻方法提取純化得到TRP[5]。 將實驗小鼠隨機分為4 組，分別為正常組、模型組、TRP 低濃度灌胃 （TRPL） 組和 TRP 高濃度灌胃（TRPH）組， 每組10 只小鼠。 正常組外其余各組小鼠用10%的水合氯醛進行麻醉（3ml/kg），然后固定小鼠按文獻方法[6]使用用顱腦打擊器打擊小鼠頭部，建立小鼠腦損傷模型。造模24h 后TRPL 和TRPH 組小鼠按濃度100mg/kg 和200mg/kg 分別灌胃TRP，持續(xù)4 周，然后進行后續(xù)實驗。

1.4.2 空間學習、記憶能力和新物體識別能力評估水迷宮實驗采用文獻方法[6]，觀察小鼠在水迷宮平臺所在象限停留時間和穿越平臺次數(shù)評估腦損傷小鼠的空間學習和記憶能力。 在10m×10m 的空曠場地上用文獻方法[6]記錄小鼠探索物體使用的時間，通過公式計算小鼠在對新物體的辨別指數(shù)(%)=探索新物體的時間/探索2 個物體的總時間×100%。

1.4.3 血清指標測定 小鼠進行眼眶取血后將血漿放入防凝血管中，然后進行離心分離（4000 r/min、10 min）， 吸出上層血清用試劑盒測定小鼠血清的SOD、CAT 酶活力和 MD 水平。

1.4.4 Western blot 實驗 斷頸處死小鼠后，取0.5g小鼠腦組織，用PBS 緩沖液洗滌后進行勻漿，然后加入裂解液進行裂解（4℃、20min），進行離心分離（4000r/min、10min）吸出上清液。 然后用 BCA 蛋白測定盒檢測提取出的蛋白總量。取100 μL（蛋白含量 30-50μg）裂解液進行上樣，在 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。然后在PVDF 膜上進行蛋白轉(zhuǎn)膜。 接著加入能夠覆蓋住轉(zhuǎn)膜的封閉液和稀釋后的一抗，在4℃下孵育12h，接著再進行洗膜，加入二抗液后在室溫下孵育1h，再次洗膜，最后用化學發(fā)光試劑進行蛋白表達顯色并檢測[12,13]。

1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理 所有的實驗進行3 次實驗，取平均值，然后用SPSS9.1 統(tǒng)計軟件采用單因素方差分析評價各組數(shù)據(jù)之間是否具有顯著差異（P<0.05）。

2 結(jié)果

2.1 腦損傷小鼠的空間學習、記憶能和新物體識別能力 由表1 可以看出，模型組小鼠逃避潛伏時間最長， 穿越平臺次數(shù)和對新舊物體的辨別指數(shù)最少。 TRP 可以顯著減少腦損傷小鼠逃避潛伏時間和增加穿越平臺次數(shù)和對新舊物體的辨別指數(shù)，且濃度越高效果越明顯。

表1 蒲公英根多酚對腦損傷小鼠的空間學習、記憶和新物體識別能力的改善效果(±s)

表1 蒲公英根多酚對腦損傷小鼠的空間學習、記憶和新物體識別能力的改善效果(±s)

注：a、b、c 分別代表正常組、TRPH 組和 TRPL 組與模型組相比具有顯著差異（P<0.05）

組別 逃避潛伏時間(s) 穿越平臺次數(shù) 對新舊物體的辨別指數(shù)(%)正常組模型組TRPL 組TRPH 組24.88±2.41a 59.35±3.82 48.77±3.18c 37.20±3.06b 6.29±0.55a 1.04±0.29 2.51±0.33c 4.62±0.37b 61.11±2.48a 31.08±3.75 42.87±3.62c 50.83±3.23b

2.2 腦損傷小鼠血清的SOD、CAT 酶活力和MDA水平 由表2 可知模型組小鼠血清的SOD 和CAT酶活力最低，而MDA 水平最高，正常組小鼠呈現(xiàn)相反的趨勢。TRP 能夠顯著（P<0.05）降低腦損傷小鼠血清中的MDA 水平和提升SOD、CAT 酶活力，其中TRPH 組小鼠血清的指標更接近正常組。

2.3 腦 損 傷 小 鼠 腦 組 織 的 SOD1、CAT、cAMP Protein Kinase Catalytic subunit 和 p-CREB 蛋白表達 由圖1 可知,模型組小鼠腦組織中SOD1、CAT、cAMP Protein Kinase Catalytic subunit 和p-CREB蛋白表達最弱，TRP 可以上調(diào)腦損傷小鼠的SOD1、CAT、cAMP Protein Kinase Catalytic subunit和p-CREB 蛋白表達， 且上調(diào)的作用與TRP 濃度呈正相關(guān)，濃度越高，表達越接近正常小鼠。

表2 蒲公英根多酚對腦損傷小鼠血清的SOD、CAT 酶活力和MDA 水平的影響(±s)

表2 蒲公英根多酚對腦損傷小鼠血清的SOD、CAT 酶活力和MDA 水平的影響(±s)

注：a、b、c 分別代表正常組、TRPH 組和 TRPL 組與模型組相比具有顯著差異（P<0.05）

8.91±0.62a 20.97±1.22 15.27±1.08c 11.02±0.76b組別 SOD (μmol/L) GSH-Px (U/ml) MDA (nmol/ml)正常組模型組TRPL 組TRPH 組210.85±19.22a 104.39±10.82 139.80±11.26c 173.52±15.48b 221.08±17.39a 80.34±6.82 112.05±12.34c 186.37±15.27b

圖1 蒲公英根多酚對腦損傷小鼠腦組織SOD1、CAT、cAMP 和 p-CREB 蛋白表達的影響

3 討論

沖擊性腦損傷對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成的損傷不僅對行動、認知產(chǎn)生影響，還可能促使學習、記憶和性格等發(fā)生變化[7]。 體現(xiàn)在動物實驗上腦損傷將導致小鼠在空間學習能力、 記憶能力和新物體識別能力上顯著區(qū)別于正常狀態(tài)[8]。 本研究中腦損傷小鼠也出現(xiàn)相同狀態(tài)，通過TRP 灌胃，可以顯著改善這些情況。

腦損傷導致腦組織發(fā)生氧化應激， 氧化平衡失調(diào)又會使腦損傷程度加劇[9]。SOD 和CAT 是體內(nèi)的抗氧化酶， 能夠起到抑制氧化應激的作用，而MDA 是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物[10,14,15]。 SOD、CAT 酶活力和MDA 水平被常作為評價機體氧化程度的指標[11]。本研究中腦損傷小鼠血清的SOD（SOD1）和GSHPx 酶活力和蛋白， 還有MDA 水平均出現(xiàn)異常，TRP 通過調(diào)節(jié)他們起到了抑制氧化應激， 保護腦組織的作用。

環(huán)磷酸腺苷（cAMP）具有調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和神經(jīng)功能的作用， 可以作為信號傳遞物質(zhì)， 對組織損傷、 缺血和缺氧的進行調(diào)節(jié)，cAMP Protein Kinase Catalytic subunit（cAMP 蛋白激酶催化亞基）是激活cAMP 的必要因子[12]。 環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白（CREB），是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，在腦細胞中大量分布, 是大腦保持記憶力的特殊蛋白質(zhì)[16]。cAMP/CREB/BDNF 信號通路正常可以保持中樞神經(jīng)的活動， 該通路也對大腦的學習和記憶力有直接影響[17]。本研究中也發(fā)現(xiàn)腦損傷小鼠中的cAMP Protein Kinase Catalytic subunit 和 p-CREB 蛋白表達低于正常狀態(tài)，TRP 能夠上調(diào)這兩個蛋白表達，修復中樞神經(jīng)系統(tǒng)，減輕腦損傷。

本研究通過動物實驗充分證明了TRP 對腦組織有明顯的保護作用， 可以減輕腦損傷及腦損傷引起的氧化應激反應。 由此可以看出TRP 具有進一步開發(fā)作為臨床藥物的潛質(zhì)。