汪志春 ，華琳 ，徐勝昔，薛國輝

（江西省九江市第一人民醫(yī)院1.乳腺外科；2.檢驗科，九江 332000）

乳腺癌已成為全球發(fā)病率最高的女性惡性腫瘤，嚴重危害女性身心健康和生活質(zhì)量[1]。 雖然隨著外科手術(shù)和輔助放化療技術(shù)的不斷提高， 乳腺癌患者預后得到大幅改善， 但由于乳腺癌高度異質(zhì)性和侵襲轉(zhuǎn)移能力，部分患者預后較差[2]。 在乳腺癌多種分型中， 三陰性乳腺癌 （triple negative breast cancer, TNBC）是一類雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體2（HER2）均為陰性的乳腺癌表型。 由于特殊受體表達情況，TNBC 患者無法使用激素治療， 且細胞分化較差，預后較差且較易復發(fā)，很多患者一經(jīng)診斷常處于晚期階段，死亡率較高[3]。 因此，深入了解TNBC 潛在的分子細胞學和免疫學機制有助于設計治療藥物。此外，TNBC 異質(zhì)性較高導致患者預后差異較大，而探究可預測TNBC 臨床預后的敏感特異生物標志物至關重要。 T 細胞免疫球蛋白域黏蛋白3（T-cell immunoglobulin and mucin domain 3, Tim-3）及其配體半乳糖凝集素（Galectin-9）可參與免疫負性調(diào)控，其在多種腫瘤中發(fā)揮免疫檢查點效應，但其在TNBC 中的研究甚少。 據(jù)此，本研究將通過測定TNBC 患者外周血單個核細胞（PBMC）細胞Tim-3和Galectin-9 mRNA 表達水平，并與臨床病理學資料展開相關性分析，探究其作為TNBC 生物標志物的可能性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集 2018 年 1 月-2019 年 12 月間于九江市第一人民醫(yī)院乳腺外科就診的TNBC 患者52 例，采集所有患者臨床資料。 納入標準：⑴符合2017 年St Gallen 共識[5]制訂的TNBC 診斷標準;⑵均為初診患者，納入研究前未接受任何手術(shù)、放化療或免疫靶向治療；⑶自愿參與本研究；⑷人口學資料齊全無缺損。 排除標準：⑴合并其他臟器嚴重疾病、自身免疫性疾病或其他腫瘤的患者；⑵納入研究前3 個月內(nèi)服用免疫抑制性藥物或激素等。 另選取50 例同期于體檢中心行健康體檢的女性作為健康對照組，該組人群排除腫瘤、自身免疫性疾病以及感染性疾病等。 兩組人群年齡間無顯著差異（P＞0.05），具有可比性。

1.2 標本采集及處理 采集TNBC 患者入院后次日、 體檢女性體檢當日清晨空腹靜脈血各6ml，其中 3ml 于 EDTA 抗凝管中,用于 PBMC 提取;另 3ml于干燥管中，3500rmp 15min 離心后分離血清，凍存至-80℃冰箱，用于檢測血清IL-10 濃度。

1.3 試劑及方法 將等體積PBS 與全血混勻后加入淋巴細胞分離液 （購自天津灝洋生物）， 隨后2000rpm 30min 行密度梯度離心，用移液器吸取中間白色云霧狀細胞層，即為PBMC。TRIZOL 法提取PBMC 總 RNA (Invitrogen 公司) 提取 PBMC 總RNA；SYBR@ Premix Ex TaqTM II（日本 TAKARA公司）用于Real time qPCR 反應，所有實驗嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。 擴增標準程序如下：95℃30s，95℃ 5s，40 個循環(huán)，退火 60℃ 30s。 內(nèi)參基因為人 β-actin， 利用 2-△△Ct法計算 Tim-3 mRNA 和Galectin-9 mRNA 的相對含量。 其中△△Ct=(Ct目的基因-Ctβ-actin)TB 組－(Ct目的基因-Ctβ-actin)對照組。 引物序列見表1。

Human IL-10 Quantikine ELISA Kit （美國R&D 公司）用于檢測血清IL-10 的水平，所有步驟嚴格按照試劑盒說明說操作。

1.4 統(tǒng)計學處理 利用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件分析所有實驗數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，兩樣本比較采用獨立樣本t 檢驗；計數(shù)資料采用百分比表示，組間差異采用卡方檢驗。 指標間相關性利用Spearman 分析，P＜0.05 視為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 Real-time qPCR 引物序列及產(chǎn)物大小

2 結(jié)果

2.1 TNBC 患者與健康對照組實驗室資料比較 與健康對照組相比，TNBC 患者外周血WBC、LYM、MON、Hb 和ALB 均顯著下降， 差異具有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05）。 而 NEU 和 PLT 雖有所減少，但與健康對照組比差異并無統(tǒng)計學意義 （P 均＞0.05）。見表2。

表2 TNBC 患者與健康對照組實驗室指標比較(±s)

表2 TNBC 患者與健康對照組實驗室指標比較(±s)

參數(shù) TNBC（n=52） 對照組（n=50） t P WBC(×109)NEU(×109)LYM(×109)MON(×109)PLT(×109)Hb(g/L)ALB(g/L)5.63±1.59 3.47±1.26 1.62±0.56 0.39±0.13 211.16±58.37 127.20±12.89 45.04±3.22 6.75±1.57 3.80±1.13 2.28±0.50 0.46±0.18 227.17±41.51 147.63±14.13 48.22±2.35 3.509 1.385 6.199 2.318 1.564 7.523 5.296 0.0007 0.1692＜0.0001 0.0226 0.1211＜0.0001＜0.0001

2.2 TNBC 患者與健康對照組 Tim-3 mRNA、Galectin-9 mRNA 和IL-10 比較 與健康對照組相比 TNBC 患者外周血 PBMC 中 Tim-3 mRNA 和Galectin-9 mRNA 的表達水平均顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 此外，血清 IL-10 濃度亦顯著高于健康對照組（P＜0.05）。 見圖1。

圖1 TNBC 患 者 Tim-3 mRNA（A）、Galectin-9 mRNA（B）和 IL-10（C）的表達變化

2.3 TNBC 患者 Tim-3 mRNA、Galectin-9 mRNA與臨床病理學資料間的關系 依據(jù)腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、TNM 分期以及Ki67 將TNBC 患者分組， 分析比較外周血Tim-3 mRNA 和Galectin-9 mRNA 差異。 結(jié)果顯示外周血Tim-3 mRNA 在不同 Ki67 組間并無顯著差異（P＞0.05）；Tim-3 mRNA在腫瘤大于2cm 的患者、 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者以及III+IV 期患者中均顯著增加， 差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 Galectin-9 mRNA 在腫瘤大于 2cm 的患者中顯著高于低于2cm 的患者，在Ki67、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期不同組間并無顯著差異 （P＞0.05）。見表3。

表3 TNBC 患者外周血Tim-3 mRNA、Galectin-9 mRNA 與臨床病理學參數(shù)間關系(±s)

表3 TNBC 患者外周血Tim-3 mRNA、Galectin-9 mRNA 與臨床病理學參數(shù)間關系(±s)

*：P＜0.05

臨床參數(shù) 例數(shù) Tim-3 mRNA Galectin-9 mRNA Ki67≤50%＞50%淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36 15 8.61±3.38 9.18±3.27 5.39±1.95 5.18±2.45否 是30 21 7.98±2.93 10.12±3.60*5.37±1.96 5.25±2.34 4.94±2.06 5.87±2.12腫瘤大?。?cm≤2cm TNM 分期I+II III+IV 26 25 9.89±3.52*7.62±2.72 6.25±1.98*4.37±1.77 30 21 7.41±2.77 10.73±3.12*

2.4 TNBC 患者 Tim-3 mRNA、Galectin-9 mRNA與IL-10 的相關性 相關性結(jié)果顯示，TNBC 患者Tim-3 mRNA 和 Galectin-9 mRNA 均與血清 IL-10 濃度呈顯著正相關性， 此外Tim-3 mRNA 表達量與Galectin-9 mRNA 亦呈顯著正相關性， 見圖2。

圖2 TNBC 患者 Tim-3 mRNA、Galectin-9 mRNA 及 IL-10 間的相關性。A：IL-10 與 Tim-3 mRNA 顯著正相關；B：IL-10 與Galectin-9 mRNA 顯 著 正 相 關 ；Galectin-9 mRNA 與 Tim-3 mRNA 顯著正相關

3 討論

TNBC 與其他類型乳腺癌的顯著差異即為其顯著的侵襲性和較差的臨床預后。TNBC 約占所有侵襲性乳腺癌的10%-20%，且其具有影響年輕女性的趨勢[6]。 臨床資料顯示TNBC 患者具有更高的復發(fā)率和更低的生存率。 實際上，轉(zhuǎn)移性TNBC 患者5 年生存率低于30%，而總體生存率更是接近0[7]。 造成這種較差預后的潛在原因可能是因為TNBC 常具有一些獨特的免疫和分子特征，這些特征也局限了其治療選擇[8]。 因為缺乏激素受體，TN BC 無法使用在其他非TNBC 乳腺癌中發(fā)揮高效治療效應的激素療法。而TNBC 患者只能接受副作用較強的化療方案，但其有效率僅為1/3，因此弄清TNBC 獨特的免疫學機理對于開發(fā)新的靶向治療尤為關鍵[9]。

Tim-3 是Th1 細胞特異性表面分子，可負性調(diào)控Th1 細胞介導的免疫反應[10]。 Tim-3 發(fā)揮免疫調(diào)控功能需要與其配體半乳糖凝集素（Galectin-9）特異性結(jié)合介導鈣-該蛋白酶-半胱天氡酶依賴的凋亡途徑實現(xiàn)免疫抑制效應。 既往研究證實Tim-3/Galectin-9 具有調(diào)控細胞凋亡、控制炎癥以及免疫調(diào)節(jié)作用， 其在腫瘤中的作用也愈發(fā)引起人們的關注[11]。 Tim-3 在實體腫瘤和血液腫瘤模型中指示抑制性和功能紊亂性CD8+T 細胞， 提示Tim-3 可能是腫瘤誘導的免疫抑制中的關鍵檢查點分子。Tim-3 也被發(fā)現(xiàn)在癌癥患者T 細胞表面高表達[12]。在活化的CD8+腫瘤內(nèi)浸潤性淋巴細胞表面高表達的Tim-3 分子誘導效應性T 細胞的功能降低及衰竭， 因此腫瘤微環(huán)境中Tim-3 的過表達是腫瘤免疫逃逸的一個主要原因。 雖然Tim-3 在腫瘤細胞的具體作用機制還尚未被了解清楚， 但既往研究結(jié)果已經(jīng)表明Tim-3 或可成為腫瘤患者的獨立預后因子， 且給予抗Tim-3 抗體有望成為改善腫瘤治療可行的途徑[13]。 比如，在前列腺癌中過表達的Tim-3 已經(jīng)被證實是一個潛在的預后生物標志物[14]。 雖然目前在包括肝細胞癌、消化道腫瘤及宮頸癌等多種腫瘤中均有關于Tim-3 的研究， 但對于其在乳腺癌中的研究數(shù)據(jù)甚少，其與TNBC 患者的關系更是少有報道。 而Wang 等[15]學者近期研究證實Tim-3 基因多態(tài)性與中國人群乳腺癌患者密切相關，提示Tim-3 與乳腺癌發(fā)病存在關聯(lián)。 本研究在 TNBC 患者外周血 PMBC 中發(fā)現(xiàn) Tim-3 及Galectin-9 均顯著高表達，且與臨床病理學資料密切相關。有學者[16]在胃癌患者外周血單核細胞表面發(fā)現(xiàn)Tim-3 高水平表達， 并證實上調(diào)的Tim-3 與腫瘤侵襲程度、 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期等均密切相關,將健康人群來源的單核細胞在胃癌細胞條件化的基質(zhì)中培養(yǎng)會顯著上調(diào)Tim-3 表達。 而這些結(jié)果提示Tim-3/Galectin-9 或參與 TNBC 免疫學機理， 其高表達也提示其可能成為預后評價指標， 在未來研究中有必要對患者展開隨訪， 探究高水平Tim-3/Galectin-9 與患者復發(fā)及生存的關系。

另外， 相關性分析表明Tim-3/Galectin-9 與IL-10 濃度呈顯著正相關性，而IL-10 主要由Treg細胞分泌并在腫瘤微中扮演強效免疫抑制作用。這也提示Tim-3/Galectin-9 可能參與TNBC 異常免疫抑制細胞功能的調(diào)控。Reem Saleh 等[17]近期發(fā)現(xiàn)PBMC 與TNBC 細胞共培養(yǎng)可顯著增加Tim-3表達及Treg 細胞表面Tim-3 的表達水平， 這也提示TNBC 細胞具有通過上調(diào)Tim-3 進而誘導免疫抑制和免疫逃逸的效應。 但本研究還存在一定的缺陷，如未將非TNBC 患者納入對比研究中，而其他類型的乳腺癌免疫機理與TNBC 存在顯著差異，與之展開對比對于分析Tim-3/Galectin-9 在TNBC中的價值具有重要意義。 先前有報道發(fā)現(xiàn)Tim-3+的基質(zhì)腫瘤浸潤淋巴細胞在乳腺癌中顯著升高，且各臨床亞型間具有顯著差異，其中TNBC 顯著高于Luminal A 和Luminal B 型患者，但該研究并未分析外周血中Tim-3 的表達情況[18]。這在未來的研究中將進一步展開分析。

總之， 本研究發(fā)現(xiàn)TNBC 患者外周血Tim-3和Galectin-9 水平顯著上調(diào)，并與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和 TNM 分期密切相關。 此外，Tim-3/Galectin-9 還與免疫抑制性細胞因子IL-10 呈顯著正相關性。 Tim-3/Galectin-9 可能參與了TNBC獨特的免疫機理，為其基礎研究提供新的思路。