紀(jì) 鵬，王偉隆，戴 穎，蔣 剛，黃旭雄,2,3

(1.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海201306；2.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201306；3.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海201306)

微藻種類繁多、分布廣泛，是水域生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級(jí)生產(chǎn)者。與傳統(tǒng)農(nóng)作物相比，微藻具有光合效率和表面積生產(chǎn)力高，營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單，占用土地面積少等優(yōu)勢(shì)。微藻在固定CO2、凈化廢水、調(diào)節(jié)水質(zhì)方面發(fā)揮著重要作用。微藻中含有豐富的色素、脂質(zhì)、碳水化合物和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)成分，可作為各種增值產(chǎn)品的原料，如生物柴油、顏料、生物醫(yī)藥和營(yíng)養(yǎng)品等[1-2]。

微藻的生長(zhǎng)率和生物量生產(chǎn)力通常取決于它們指數(shù)期內(nèi)將生物量翻倍的能力[3]。藻類的生長(zhǎng)受多種環(huán)境因子的影響[4-5]，如溫度、鹽度、光照、pH等，其中光照是促進(jìn)微藻細(xì)胞生長(zhǎng)及其代謝活性的首要因素[6-8]，是微藻將CO2轉(zhuǎn)化為有機(jī)物質(zhì)的必要能源，不僅影響微藻的光合速率和產(chǎn)量，而且影響藻細(xì)胞的生物化學(xué)組分，許多研究表明光照對(duì)色素、脂質(zhì)和碳水化合物等細(xì)胞組分含量有所影響[9-10]。在藻類的長(zhǎng)期進(jìn)化中，不同種類的微藻對(duì)光照的適應(yīng)存在差異，因此，適宜的光照度對(duì)微藻的生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物的積累都至關(guān)重要。

綠球藻(Chlorococcumsp.)能夠利用有機(jī)碳源進(jìn)行兼養(yǎng)培養(yǎng)，具有耐高溫[11]和高氨氮[12]的特性，在養(yǎng)殖廢水凈化處理和水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖方面具有很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值和前景，關(guān)于綠球藻生長(zhǎng)所需的溫度、碳源和營(yíng)養(yǎng)方式等影響因子已經(jīng)做了研究，但其對(duì)于光照度的需求還未有過(guò)探究。本研究分別在不同的光照度下對(duì)綠球藻進(jìn)行兼養(yǎng)培養(yǎng)，測(cè)定并分析了光照度對(duì)綠球藻生長(zhǎng)、色素、脂質(zhì)、碳水化合物和脂肪酸的影響，為綠球藻的大規(guī)模培養(yǎng)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)用綠球藻來(lái)自上海海洋大學(xué)生物餌料培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的綠球藻藻液，經(jīng)3 000 r/min離心收集藻細(xì)胞，然后接種到1 L的滅菌三角燒瓶中，初始密度為5×106cells/mL，實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)6個(gè)光照度，分別為0、1 500、3 000、4 500、6 000、7 500 lux，每個(gè)梯度3個(gè)平行，共18個(gè)樣品，實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基為改良f/2培養(yǎng)基，主要成分為(mg/L)：C6H12O6500，NaNO3150，NaH2PO48.8，ZnSO4·4H2O·46，CuSO4·5H2O 20，MnCl2·4H2O 356，F(xiàn)eC6H5O7·5H2O 7800，NaMoO4·2H2O 14.6，Na2EDTA 8700，CoCl2·6H2O 24。實(shí)驗(yàn)在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度(35±1)℃，光周期12L ∶12D，每天定時(shí)搖藻4次，培養(yǎng)7 d。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.1 綠球藻細(xì)胞密度、特定生長(zhǎng)率和生物量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)期間，每天采用XB-K-25血球計(jì)數(shù)板測(cè)定綠球藻細(xì)胞密度，每個(gè)樣品測(cè)定3次，并計(jì)算綠球藻的特定生長(zhǎng)率K。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將100 mL藻液通過(guò)微孔濾膜(孔徑0.45 μm)抽濾，之后將濾膜置于85 ℃烘箱中烘干至恒重，并計(jì)算生物量(B)。

K=(lnNt-lnN0)/t

(1)

B(g/L)=(W1-W0)/V

(2)

式中，N0：初始藻細(xì)胞密度(cells/mL)；Nt：經(jīng)過(guò)時(shí)間t后藻細(xì)胞密度(cells/mL)；t：培養(yǎng)時(shí)間(d)；W0：微孔濾膜的質(zhì)量(g)；W1：含有藻液的微孔濾膜的質(zhì)量(g)；V：測(cè)定生物量所需藻液體積(L)。

1.3.2 綠球藻營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取一定體積的藻液，離心后用去離子水清洗三次，獲取藻泥，并用甲醇提取綠球藻色素，采用分光光度計(jì)法[13-14]測(cè)定色素含量，根據(jù)以下公式計(jì)算葉綠素a(Pa)、葉綠素b(Pb)、類胡蘿卜素(Pc)含量，最后，根據(jù)藻細(xì)胞密度和生物量換算成百分含量。

Pa(μg/106cells)=(-8.096 2×A652+16.516 9×A665)×V1/V2/細(xì)胞密度×106

(3)

Pb(μg/106cells)=(27.440 5×A652-12.168 8×A665)×V1/V2/細(xì)胞密度×106

(4)

Pc(μg/106cells)=4×A480×V1/V2/細(xì)胞密度×106

(5)

式中，A480、A652、A665分別是在波長(zhǎng)為480、652、665 nm下測(cè)定的吸光度；V1：甲醇體積(mL)；V2：測(cè)定藻液體積(mL)。

之后，將剩余藻液離心，并用去離子水反復(fù)清洗3次，將獲得的藻泥置于-40 ℃下冷凍干燥，用于測(cè)定碳水化合物和總脂含量，碳水化合物含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[15]，總脂含量采用氯仿甲醇法[16]，之后采用BF3甲酯化法[17]測(cè)定脂肪酸含量，使用Agilent-7890A型氣相色譜儀聯(lián)合Agilent-5975C質(zhì)譜儀分析脂肪酸，根據(jù)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品的分析圖譜、保留時(shí)間以及質(zhì)譜的分析對(duì)脂肪酸進(jìn)行定性分析，并按照峰面積歸一化法計(jì)算各脂肪酸的相對(duì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，通過(guò)單因素方差分析和Duncan’s多重比較來(lái)評(píng)估各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的差異，P<0.05表示數(shù)據(jù)之間有顯著性差異。所有數(shù)據(jù)都使用SPSS 17.0進(jìn)行分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照度對(duì)綠球藻生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，不同光照度對(duì)綠球藻生長(zhǎng)影響不同，綠球藻在無(wú)光條件下(0 lux)沒(méi)有生長(zhǎng)，第3天藻細(xì)胞密度出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，顯著低于其它各組；在光照條件下，1 500和3 000 lux組綠球藻經(jīng)過(guò)1天的生長(zhǎng)延緩期后開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，之后進(jìn)入穩(wěn)定期，分別在第6天和第4天達(dá)到最大值24.69×106和22.93 ×106cells/mL，明顯高于其它各組；隨著光照度的進(jìn)一步增加，4 500、6 000和7 500 lux組延緩期延長(zhǎng)，綠球藻細(xì)胞密度降低。因此該綠球藻在無(wú)光條件下無(wú)法生長(zhǎng)，在低光照條件下生長(zhǎng)較好，高光照條件下生長(zhǎng)受到抑制。

圖1 不同光照度對(duì)綠球藻細(xì)胞密度的影響

由表1可知，綠球藻在光照度為0 lux時(shí)，特定生長(zhǎng)率最小，為0.03，顯著低于其它各組，隨著光照度的增加，特定生長(zhǎng)率先增大后減小，在光照度為1 500 lux達(dá)到最大值0.24，顯著高于6 000和7 500 lux組。隨著光照度的增加，綠球藻生物量先增大后減小，0 lux組生物量顯著低于其余各組，當(dāng)光照度為1 500和3 000 lux時(shí)，綠球藻具有較高的生物量，分別為0.47、0.44 g/L，顯著高于其它各組。由此可知，綠球藻最佳生長(zhǎng)所需光照度為1 500～3 000 lux。

表1 不同光照強(qiáng)度對(duì)綠球藻特定生長(zhǎng)率、生物量和類胡蘿卜素/葉綠素的影響

2.2 不同光照強(qiáng)度對(duì)綠球藻營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響

綠球藻細(xì)胞色素含量受光照度的影響，由圖2可知，隨著光照度的增加，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素均表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢(shì)，光照度為3 000 lux時(shí)色素含量較高，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量分別為0.41%、0.06%、0.10%，與1 500 lux組無(wú)顯著差異，但顯著高于其它各組。在光照條件下，隨著光照強(qiáng)度的增加，綠球藻類胡蘿卜素/葉綠素比值增大(見(jiàn)表1)，7 500 lux組達(dá)到最大值0.23，顯著高于1 500、3 000和4 500 lux組。

圖2 不同光照強(qiáng)度對(duì)綠球藻色素含量的影響

由圖3可知，隨著光照度的增加，總脂含量在0 lux組有最大值17.53%，顯著高于其它各組，隨著光照度從1 500增加到7 500 lux，總脂含量無(wú)顯著變化；碳水化合物含量在0 lux組顯著低于其它各組，其余各組之間無(wú)顯著差異。

圖3 不同光照強(qiáng)度對(duì)綠球藻總脂和碳水化合物的影響

光照度影響綠球藻的脂肪酸類型和含量，對(duì)綠球藻脂肪酸組成測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，綠球藻中主要含有C16和C18脂肪酸，其中C16 ∶0、C18 ∶2n6(亞油酸LA)、C18 ∶3n3(亞麻酸ALA)含量較高。隨著光照度的增加，C14 ∶0、C16 ∶0、C18 ∶0、C16 ∶1、C17 ∶1含量降低，從而導(dǎo)致飽和脂肪酸(SFA)和單不飽和脂肪酸(MUFA)含量減小；0～3 000 lux，多不飽和脂肪酸(PUFA)含量隨著光照度的增大逐漸提高，當(dāng)光照度大于3 000 lux后不再有顯著性變化；隨著光照度的增加，LA含量先增大后減小，在光照度為1 500 lux時(shí)達(dá)到最大值25.46%，ALA含量隨著光照度的增加而增加，當(dāng)光照度大于4 500 lux時(shí)不再變化，維持在43%～44%左右。

表2 不同光照強(qiáng)度對(duì)綠球藻脂肪酸組成的影響(%總脂肪酸)

3 討論

本研究結(jié)果表明該綠球藻在無(wú)光照條件下無(wú)法生長(zhǎng)，特定增長(zhǎng)率幾乎為0，說(shuō)明該綠球藻不能進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)。當(dāng)光照度為1 500 lux時(shí)，綠球藻細(xì)胞密度、特定生長(zhǎng)率和生物量提高并達(dá)到最大值，隨著光照度增加到3 000 lux，綠球藻不再進(jìn)一步生長(zhǎng)，當(dāng)光照度從4 500 lux增加到7 500 lux，綠球藻生長(zhǎng)下降，表明低光照促進(jìn)綠球藻生長(zhǎng)，高光抑制生長(zhǎng)，這與大多數(shù)微藻具有相同的特性，如斜生柵藻(ScenedesmusobliquusCNW-N)[18]、微綠球藻(Nannochloropsissp.)[7]、凱氏擬小球藻(Chlorellakessleri)[19]等。在無(wú)光或低光照度下，微藻生長(zhǎng)往往處于光限制狀態(tài)，光照度的增加會(huì)促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)，直到達(dá)到飽和光照度。然而，當(dāng)光照度超過(guò)飽和光度時(shí)，通常會(huì)導(dǎo)致Fv/Fm比值急劇下降，對(duì)光合系統(tǒng)Ⅱ(PS Ⅱ)造成光氧化損傷，即發(fā)生光抑制現(xiàn)象[20-21]，降低光合效率，從而降低生物量的生產(chǎn)，這與Khoeyi等[22]、Chen等[23]的研究結(jié)果相一致。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)綠球藻達(dá)到光飽和點(diǎn)所需光照強(qiáng)度為3 000 lux左右，綠球藻培養(yǎng)所需適宜的光照強(qiáng)度為1 500～3 000 lux。

色素是微藻捕光和傳遞光量子的重要成分，與光合作用效率密切相關(guān)。綠藻中主要存在葉綠素和類胡蘿卜素兩類色素。本研究結(jié)果表明，當(dāng)光照度從0增加到3 000 lux，綠球藻葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均不斷提高，這是由于在光限制條件下，藻類可以通過(guò)增加光合單位的數(shù)量及光捕獲色素蛋白復(fù)合體的大小來(lái)增加細(xì)胞的色素[24-25]，提高采光能力，使光合速率維持在較高水平。當(dāng)光照度超過(guò)3 000 lux，綠球藻各色素含量開(kāi)始逐漸下降，其原因主要是在高光照度下，細(xì)胞不需要較高的色素來(lái)捕獲光量子，并通過(guò)降低色素含量減少對(duì)光的吸收，從而避免光氧化損傷[26-27]。類胡蘿卜素除了具有捕光功能外，在保護(hù)藻細(xì)胞免受光抑制中發(fā)揮著主要作用，本研究結(jié)果表明，在光照條件下，隨著光照度的增加，類胡蘿卜素/葉綠素之比逐漸增大，這與對(duì)杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)[28]的研究結(jié)果類似。當(dāng)受到過(guò)度光照脅迫時(shí)，藻類往往能夠增加類胡蘿卜素的組成比例來(lái)應(yīng)對(duì)自身的氧化損傷，參與光保護(hù)過(guò)程。因此，在持續(xù)高光度下，葉綠素比類胡蘿卜素下降更快，所以導(dǎo)致類胡蘿卜素/葉綠素比值增大。

脂質(zhì)和碳水化合物是微藻主要的儲(chǔ)能形式[29]，研究表明微藻將獲得的能量用于脂類和碳水化合物的生物合成過(guò)程存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，與脂質(zhì)相比，碳水化合物的合成所需的ATP和NAD(P)H更少，微藻會(huì)將碳和能量?jī)A向于碳水化合物的合成[30]。本研究結(jié)果表明，在無(wú)光照條件下脂質(zhì)和碳水化合物含量相近，綠球藻無(wú)法利用光照和葡萄糖獲取能量，不存在這種競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，但在光照條件下，綠球藻總脂含量降低，碳水化合物含量升高，差異增大，說(shuō)明綠球藻能夠?qū)墓庹蘸推咸烟侵蝎@得的能量?jī)?yōu)先轉(zhuǎn)化為用于碳水化合物的合成。

C16和C18系列脂肪酸是藻類細(xì)胞合成的主要脂肪酸[31]。光照度對(duì)微藻脂肪酸組成和含量的影響因種而異，大多數(shù)研究表明較高的光照度能夠促進(jìn)SFA和MUFA的合成，降低PUFA的合成[31-33]。本研究結(jié)果表明，隨著光照度的增加，綠球藻SFA和MUFA均出現(xiàn)了不同程度的下降趨勢(shì)，而PUFA含量卻顯著提高，尤其是ALA，這與Krzeminska等[32]研究結(jié)果不同，但與Liu等[34]研究結(jié)果一致。光能夠誘導(dǎo)基質(zhì)中的pH、Mg2+和NADPH的變化，最終影響和調(diào)節(jié)脂肪酸合成過(guò)程中關(guān)鍵酶的活性[35]。PUFA是光合膜的重要組成成分，在維持光合膜的結(jié)構(gòu)完整和功能方面發(fā)揮著重要作用，隨著光照度的增加，微藻能夠通過(guò)加速D1蛋白的合成來(lái)完成脂肪酸的去飽和，從而提高藻細(xì)胞對(duì)光的耐受能力[36-37]。另一方面，碳鏈的去飽和過(guò)程中需要分子氧的參與[38]，隨著光照度的增加，綠球藻光合效率提高，產(chǎn)生更多的分子氧，加速碳鏈的去飽和，從而促進(jìn)PUFA的合成，當(dāng)光照達(dá)到飽和點(diǎn)后，PUFA不再增加。因此，在低光照度下，有利于綠球藻SFA和MUFA的合成，在高光照度下，有利于PUFA的合成。

綜上，綠球藻在光照度為3 000 lux生長(zhǎng)時(shí)可獲得較高的細(xì)胞密度和生物量，同時(shí)，綠球藻色素、碳水化合物和PUFA含量也維持在較高水平。