張小琴 覃仙鳳

摘要?為研究重金屬Cu2+對(duì)棘腹蛙蝌蚪的急性毒性效應(yīng)，通過單一變量急性毒性試驗(yàn)研究其在室內(nèi)條件（溫度16～20 ℃、濕度885%左右）對(duì)棘腹蛙蝌蚪的毒性效應(yīng)。結(jié)果表明：根據(jù)寇氏法原理，得到Cu2+對(duì)2月齡棘腹蛙蝌蚪在24、48、72、96 h時(shí)的半致死濃度（LC50）分別為1.160、1.136、1.191和0.870 mg/L。依據(jù)安全濃度計(jì)算公式，計(jì)算出安全濃度為0.087 mg/L。根據(jù)毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，比較了Cu2+對(duì)不同種類蝌蚪的毒性程度，發(fā)現(xiàn)棘腹蛙蝌蚪的耐受性較弱。該研究可為水環(huán)境監(jiān)測(cè)以及其他相關(guān)重金屬離子的毒性研究提供參考，為更好地保護(hù)棘腹蛙蝌蚪提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)材料。

關(guān)鍵詞?Cu2+;棘腹蛙蝌蚪;急性毒性;毒性評(píng)價(jià);半致死濃度（LC50）

中圖分類號(hào)?S?917.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2020）17-0115-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.17.029

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on the Acute Toxicity of Copper Ions to Tadpoles of Quasipaa boulengeri

ZHANG Xiao?qin， QIN Xian?feng

（College of Resources and Environment， Aba Teachers University， Wenchuan，Sichuan623002）

Abstract?In order to study the acute toxic effects of heavy metal Cu2+ on the tadpoles of Quasipaa boulengeri， a single?variable acute toxicity test was conducted to study the toxic effects of indoor conditions （temperature 16-20 ℃， humidity 88.5%） on the tadpoles. The results showed that the semi?lethal concentration （LC50） of heavy metal Cu2+ at 24， 48， 72 and 96 h were 1.160， 1.136， 1.191， 0.870 mg/L， respectively. According to the safe concentration calculation formula， the safe concentration was calculated to be 0.087 mg/L. According to the toxicity evaluation criteria， the toxicity degree of Cu2+ to different species of tadpoles was compared， and the tadpoles of Q.boulengeri were weakly tolerated. This study can provide references for water environment monitoring and other related heavy metal ion toxicity studies， and provide basic data materials for better protection of Q. boulengeri.

Key words?Cu2+;Tadpoles of Quasipaa boulengeri;Acute toxicity;Toxicity evaluation;Semi?lethal concentration （LC50）

由于汶川地質(zhì)災(zāi)害及洪澇災(zāi)害引發(fā)化工原料泄露、環(huán)保設(shè)施破壞等環(huán)境問題，使得土壤水域中富含重金屬，如Cu2+、Hg2+、Ag+等[1]。當(dāng)水環(huán)境中的重金屬含量超過蝌蚪的耐受程度，會(huì)對(duì)生活在汶川的兩棲類動(dòng)物特別是棘腹蛙蝌蚪有一定影響。棘腹蛙俗名石蛙、石雞、梆梆魚等，棘腹蛙在食用、藥用、科研、生態(tài)環(huán)境等方面的價(jià)值極高，但最近幾年人為因素及環(huán)境因素導(dǎo)致棘腹蛙個(gè)體數(shù)量大幅度減少，1920年確定棘腹蛙（Quasipaa boulengeri）亦稱棘胸蛙（Quasipaa tibetanus），屬于同物異名。棘腹蛙已經(jīng)先后被列入《中國(guó)瀕危物種紅皮書》和《中國(guó)物種紅色名錄》。棘腹蛙蝌蚪皮膚滲透性強(qiáng)，對(duì)外界環(huán)境的毒性影響異常敏感，在這一階段試驗(yàn)的最大致毒濃度與外界環(huán)境頗為相似。國(guó)內(nèi)外有關(guān)重金屬對(duì)棘腹蛙蝌蚪的毒理研究較少，國(guó)內(nèi)有學(xué)者研究了棘胸蛙在氨氮脅迫條件下毒理試驗(yàn)[2]，也有學(xué)者研究了重金屬Cu2+脅迫對(duì)棘腹蛙存活、行為和體重增長(zhǎng)的影響[3]，但缺少Cu2+對(duì)棘腹蛙蝌蚪的急性毒性研究。其中水環(huán)境中的Cu2+易致早期的棘腹蛙蝌蚪大量死亡，從而造成棘腹蛙個(gè)體的成活率大幅度降低。筆者探究了重金屬Cu2+對(duì)棘腹蛙蝌蚪的急性毒性影響，旨在為水環(huán)境檢測(cè)以及其他相關(guān)重金屬離子對(duì)棘腹蛙蝌蚪的毒性研究提供參考，以更好地保護(hù)棘腹蛙蝌蚪。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?試驗(yàn)試劑。

硫酸銅（CuSO4）、冰乙酸（CH3COOH）。

1.1.2?試驗(yàn)器材。

透明方箱（28.0 cm×19.5 cm×16.5 cm）、燒杯、電子天平、pH試紙、游標(biāo)卡尺、溫度計(jì)、小米米家智能攝像機(jī)等，均由阿壩師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3?試驗(yàn)動(dòng)物及分組。

棘腹蛙蝌蚪購(gòu)自雅安市林溪地棘胸蛙養(yǎng)殖專業(yè)合作社，隨機(jī)選擇大小均勻、食欲強(qiáng)、活動(dòng)能力強(qiáng)的2月齡棘腹蛙蝌蚪500尾（平均體長(zhǎng)3.97 cm，平均體重0.41 g），分為試驗(yàn)組和對(duì)照組。

1.1.4?水處理。

飼養(yǎng)蝌蚪用水為阿壩師范學(xué)院后山小溪取得，將溪水通風(fēng)靜置2 d后使用，以沉淀泥沙，避免對(duì)棘腹蛙蝌蚪的試驗(yàn)結(jié)果造成影響。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?試驗(yàn)溶液的配制。

準(zhǔn)確稱量CuSO4 0.1 g，將其溶于100 mL水中，再加入適量的冰乙酸，抑制Cu2+的水解，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的母液，備用。

1.2.2?蝌蚪的飼養(yǎng)。

投放熟飼料、熟白菜交替喂養(yǎng)，每隔24 h換1次水以及喂食。

1.2.3?預(yù)試驗(yàn)。

參考相關(guān)文獻(xiàn)[3]，在較大范圍內(nèi)對(duì)少量蝌蚪進(jìn)行試驗(yàn)。各試驗(yàn)組試驗(yàn)溶液濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、3.0、4.0 mg/L，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（試驗(yàn)溶液濃度為0 mg/L），每個(gè)濃度梯度下設(shè)置1 個(gè)平行對(duì)照組。在每個(gè)容器中加入1 L處理后的水，分別加入不同濃度梯度的硫酸銅溶液，每個(gè)容器中放入10尾蝌蚪。試驗(yàn)溶液pH為7，水溫為17.3～20.5 ℃，室內(nèi)溫度為16～20 ℃，濕度為75.9%，每隔24 h換試驗(yàn)溶液1次，并喂食。試驗(yàn)開始時(shí)安裝攝像機(jī)，觀察蝌蚪的中毒癥狀，并分別記錄4、12、24、48、72、96 h時(shí)蝌蚪死亡數(shù)量。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，得出試驗(yàn)的最小致死濃度和最大安全濃度，從而確定正式試驗(yàn)的濃度范圍。

1.2.4?正式試驗(yàn)。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，按等差質(zhì)量濃度梯度設(shè)置各試驗(yàn)組試驗(yàn)溶液濃度分別為0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mg/L。每個(gè)濃度梯度均設(shè)置3個(gè)平行組，同時(shí)設(shè)置了3個(gè)空白對(duì)照組（試驗(yàn)溶液濃度為0 mg/L），貼好標(biāo)簽紙。在每個(gè)容器中加入1 L水，用吸量管取適量的配制好的母液滴入對(duì)應(yīng)容器中。隨機(jī)選取蝌蚪10尾，放養(yǎng)于容器中。測(cè)量并記錄水溫、pH、室內(nèi)溫度和濕度等。采用靜止試驗(yàn)法[4]，試驗(yàn)開始后觀察蝌蚪的中毒情況，前4 h進(jìn)行連續(xù)觀察，并及時(shí)撈出死亡個(gè)體，以免污染水質(zhì)（死亡標(biāo)準(zhǔn)以用玻璃棒觸動(dòng)蝌蚪時(shí)，其身體無反應(yīng)），隨后觀察并記錄12、24、48、72、96 h時(shí)的死亡數(shù)量。試驗(yàn)期間注重觀察蝌蚪的平衡、游動(dòng)及體色狀態(tài)。

1.2.5?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

半致死濃度（LC50）采用寇氏法原理來計(jì)算;安全濃度（SC）采用公式SC=96 h LC50×0.1來計(jì)算;最后，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?預(yù)試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果得知，試驗(yàn)溶液pH為7.0，水溫為17.3～20.5 ℃，室內(nèi)溫度為18～20 ℃，濕度為75.9%。在24 h內(nèi)濃度分別為3和4 mg/L的試驗(yàn)組蝌蚪全部死亡，在96 h內(nèi)濃度為2 mg/L的蝌蚪全部死亡。根據(jù)以上結(jié)果，確定最小致死濃度為2 mg/L，最大安全濃度為1 mg/L。因此，確定正式試驗(yàn)的濃度梯度為0.8～2.2 mg/L。在前4 h內(nèi)，濃度0.1～1.0 mg/L的試驗(yàn)組蝌蚪無明顯中毒癥狀，而濃度2～4 mg/L試驗(yàn)組蝌蚪表現(xiàn)出明顯的中毒癥狀（明顯出現(xiàn)頭暈，身體擺動(dòng)劇烈，不定向運(yùn)動(dòng)，在水中側(cè)翻后又恢復(fù)正常，懸浮在水中，連續(xù)以往動(dòng)作，不久后身體失衡側(cè)翻或仰臥在水中）。

2.2?正式試驗(yàn)

2.2.1?中毒癥狀。

在試驗(yàn)溶液pH 7.0，水溫18.4～19.2 ℃，室內(nèi)溫度16～20 ℃，濕度88.5%的條件下，Cu2+對(duì)蝌蚪的中毒癥狀結(jié)果如圖1～3所示。

使用攝像設(shè)施連續(xù)觀察蝌蚪的行為變化。從圖1～3可以看出，中毒前，蝌蚪的體色正常，活躍能力強(qiáng);中毒后，蝌蚪運(yùn)動(dòng)強(qiáng)烈，尾末端擺動(dòng)明顯，上下翻騰，體表有分泌物，體色變淡，試液混濁，不久后身體徹底失衡，仰臥于水中，死亡的蝌蚪體表變灰，尾鰭透明，皮膚出現(xiàn)潰爛。

2.2.2?Cu2+對(duì)棘腹蛙蝌蚪的急性毒性影響。

在96 h內(nèi)不同質(zhì)量濃度的Cu2+處理后累計(jì)2月齡棘腹蛙蝌蚪死亡數(shù)及其急性試驗(yàn)結(jié)果如表1、2所示。

由表1可知，隨著Cu2+濃度的增加及時(shí)間的延長(zhǎng)，棘腹蛙蝌蚪數(shù)量死亡數(shù)增多。由于蝌蚪的體表滲透能力強(qiáng)，Cu2+濃度越大，對(duì)蝌蚪的刺激性越強(qiáng)，毒性越強(qiáng);較小的個(gè)體先死亡。大多數(shù)水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用0.7 mg/L CuSO4溶液（含Cu2+0.178 mg/L）噴灑全池，為防治原生動(dòng)物疾病以及藻類生長(zhǎng)而危及多數(shù)兩棲動(dòng)物的生長(zhǎng)[4]。由于棘腹蛙的LC50低于0178 mg/L，耐毒性極弱，對(duì)于棘腹蛙蝌蚪的傷害較大，表明此種噴灑方式對(duì)于2月齡棘腹蛙蝌蚪的疾病預(yù)防是不可行的。

由表2可知，隨著Cu2+濃度的增加，在96 h內(nèi)的累計(jì)2月齡棘腹蛙蝌蚪死亡數(shù)及死亡率逐漸增大，在2.0和2.2 mg/L濃度條件下累計(jì)死亡數(shù)及死亡率均達(dá)到最大值，蝌蚪全部死亡。

根據(jù)表1試驗(yàn)結(jié)果，再通過回歸分析得出Cu2+對(duì)蝌蚪的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果（表3）。在24、48、72、96 h Cu2+的LC50分別為1.160、1.136、1.191和0.870 mg/L。依據(jù)SC計(jì)算公式，計(jì)算出SC為0.087 mg/L。根據(jù)《水生生物監(jiān)測(cè)手冊(cè)》中對(duì)魚類（蝌蚪）毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及我國(guó)化學(xué)物質(zhì)毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（96 h LC50 <1.0 mg/L 時(shí)為急性毒性Ⅰ級(jí)，1.0 mg/L ≤96 h LC50 <10.0 mg/L 為急性毒性Ⅱ級(jí)，10.0 mg/L≤96 h LC50 ≤ 100.0 mg/L 為急性毒性Ⅲ級(jí)），可判定Cu2+對(duì)棘腹蛙蝌蚪的急性毒性等級(jí)為Ⅱ級(jí);根據(jù)《水生生物監(jiān)測(cè)手冊(cè)》中農(nóng)藥對(duì)魚類（蝌蚪）的毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)（劇毒，96 h LC50<1.0 mg/L;高毒，1.0 mg/L ≤96 h LC50 <100.0 mg/L;中低毒，100.0 mg/L≤96 h LC50 <1 000.0 mg/L;低毒，1 000.0 mg/L≤96 h LC50 ≤10 000.0 mg/L ;微毒或無毒，96 h LC50 >10 000.0 mg/L），判定2月齡棘腹蛙蝌蚪對(duì)Cu2+的毒性等級(jí)為劇毒。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，對(duì)照組中的蝌蚪正常游動(dòng)，未出現(xiàn)任何中毒癥狀，無死亡個(gè)體;其他試驗(yàn)組均出現(xiàn)不同程度的中毒狀況及死亡狀態(tài)。

3?結(jié)論與討論

由Cu2+對(duì)2月齡棘腹蛙蝌蚪的毒性試驗(yàn)結(jié)果可知，在同一質(zhì)量濃度下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蝌蚪的死亡數(shù)增加，死亡率逐漸升高;在相同時(shí)間內(nèi)，Cu2+的質(zhì)量濃度越大，蝌蚪的死亡數(shù)越多，死亡率越大，并且當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到一定濃度時(shí)，死亡速率極快;個(gè)體小的蝌蚪比個(gè)體大的蝌蚪先死亡。棘腹蛙蝌蚪對(duì)于Cu2+的耐受性極弱，2月齡棘腹蛙蝌蚪對(duì)Cu2+的毒性等級(jí)為劇毒。重金屬急性毒性試驗(yàn)對(duì)蝌蚪的行為形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育、機(jī)體酶活性、組織器官、遺傳等方面均有極大影響，從而使蝌蚪中毒。其中對(duì)蝌蚪的行為形態(tài)的影響最為明顯，主要表現(xiàn)在以下方面：游動(dòng)能力遲緩，游動(dòng)方向不確定;側(cè)翻或仰臥在水中，體色泛白，體呈僵直在水中;游動(dòng)能力遲緩;游動(dòng)方向不定向;皮膚潰爛，試驗(yàn)溶液混濁。Cu2+對(duì)蝌蚪的毒害主要通過破壞鰓結(jié)構(gòu)來影響其呼吸方式，從而使其功能紊亂，中毒死亡;還因蝌蚪皮膚的滲透性強(qiáng)，溶液中的Cu2+易滲進(jìn)皮膚，破壞內(nèi)臟器官功能，導(dǎo)致其中毒。經(jīng)以上分析可知，蝌蚪對(duì)外界環(huán)境敏感，故蝌蚪可作為環(huán)境監(jiān)測(cè)的重要指示動(dòng)物。因此，該試驗(yàn)不僅可為水環(huán)境監(jiān)測(cè)及棘腹蛙蝌蚪的相關(guān)研究提供參考，也可為保護(hù)棘腹蛙蝌蚪提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)材料。

國(guó)內(nèi)關(guān)于Cu2+對(duì)兩棲動(dòng)物的急性毒性研究較少，這里列出國(guó)內(nèi)已有的Cu2+對(duì)不同兩棲類蝌蚪的LC50（表4），LC50越大，毒性越小，蝌蚪耐受性更強(qiáng)。

不同種類的蝌蚪體長(zhǎng)及質(zhì)量與LC50并未呈現(xiàn)出線性關(guān)系。對(duì)于同一種蝌蚪，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，LC50變小。這可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，體內(nèi)毒性增強(qiáng)，耐受性減弱。

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