張 燕，賈士芳

（太原科技大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，太原030021）

癌癥是威脅人類(lèi)健康的主要問(wèn)題之一，所以研究其作用機(jī)理，尋找新的治療方法和高效低毒的抗腫瘤藥物一直是科學(xué)家們熱衷研究的前沿課題［1-4］。自從順鉑作為第一個(gè)抗腫瘤藥物后［5］，小分子金屬配合物作為抗腫瘤藥物的研究便引起了人們極大的興趣［6］。繼金屬鉑配合物之后，發(fā)現(xiàn)一些釕的配合物也有較高的抗腫瘤活性，如NAMI和KP1019，其中KP1019型釕金屬配合物現(xiàn)已進(jìn)入臨床Ⅰ期，其對(duì)Lewis肺癌和原發(fā)性直腸癌有明顯抑制作用［7-8］。NAMI對(duì)肺癌非小細(xì)胞的研究已進(jìn)入Ⅱ期臨床階段［9］。SATYANARAYANA 教 授［10］課 題 組 合 成了三 個(gè)含有 ptip［ptip＝ （2-（5-phenylthiophen-2-yl）-1H-imidazo［4，5-f］［1，10phenanthroline］配體的吡啶釕配合物，其對(duì)Hela的IC50值依次為21.7，22.4和23.1μmol／L，它們的細(xì)胞毒性均與濃度呈線(xiàn)性關(guān)系。廣東藥學(xué)院劉云軍老師課題組［11］也合成過(guò)一組單核釕配合物Ru1～3（結(jié)構(gòu)如圖1），分別測(cè)試了它們對(duì)A549，BEL-7402，MG-63和SKBR-3四種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。其中，Ru3對(duì)三種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出比順鉑好的效果。

圖1 Ru1～3的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of Ru1～3

希夫堿是含有—CH■ N—結(jié)構(gòu)的一類(lèi)有機(jī)物，因其N(xiāo)原子上連有苯環(huán)而比較穩(wěn)定。此類(lèi)有機(jī)物結(jié)構(gòu)多樣，除含有碳氮雙鍵外，通常還含有羥基等其它可提供孤對(duì)電子的基團(tuán)，使其易與金屬離子形成配合物，而且形成的配合物具有豐富的電子光譜和電化學(xué)性質(zhì)，因此希夫堿及其配合物一直是炙手可熱的研究對(duì)象［12-17］?；谶@兩點(diǎn)本文將金屬釕與希夫堿配體反應(yīng)，得到兩個(gè)單核釕配合物，通過(guò)元素分析、紅外光譜、電噴霧質(zhì)譜和核磁氫譜對(duì)它們進(jìn)行表征。此外，還對(duì)配合物做了紫外-可見(jiàn)吸收光譜和電化學(xué)測(cè)試。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法研究了兩個(gè)配合物對(duì)宮頸癌細(xì)胞（Hela）、乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）和胃癌細(xì)胞（BGC823）三種腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

AL204分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DF-101B恒溫磁力攪拌器（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；PE20005型元素分析譜儀（美國(guó)PE公司）；Varian Mercury VX-300型核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；Nicolet38型傅立葉紅外光譜儀（thermo electron corporation）；TU-1901紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；CHI630E型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；EPICS XL-MCL型酶標(biāo)儀（美國(guó) Beckman Coulter公司）；EPICS XL-MCL型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

三水合三氯化釕、2，2′-聯(lián)吡啶（bpy）、4，4′-二氨基二苯硫醚、2-吡啶甲醛、硼氫化鈉、氘代三氯甲烷、氘代二甲基亞砜等均為市售分析純?cè)噭?，?gòu)于武漢申試化工有限公司，所有試劑都未經(jīng)純化直接使用。使用的水為蒸餾水。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2 目標(biāo)化合物的合成

1.2.1 合成路線(xiàn)圖

配體及配合物的合成路線(xiàn)見(jiàn)圖2.

1.2.2 配體及配合物的合成

配體L1的合成：稱(chēng)取4，4′-二氨基二苯硫醚1.08g（5mmol），2-吡啶甲醛1.30g（12mmol），溶于25mL甲醇溶液中，加熱回流4h.反應(yīng)結(jié)束后，將溶液冷卻過(guò)濾，濃縮至干得油狀物，用二氯甲烷處理產(chǎn)物，得黃綠色固體粉末，用乙醚多次洗滌，真空干燥，得產(chǎn)物1.83g，產(chǎn)率93%.分子式：C24H18N4S.元素分析實(shí)驗(yàn)值（%）：C 73.07，H 4.59，N 14.25；計(jì)算值：C 73.10，H 4.57，N 14.21.1H NMR（300 MHz，CDCl3）：8.72（d，J＝4.2Hz，2H），8.61（s，2H），8.20（d，J＝7.9Hz，2H），7.82（t，J＝7.1Hz，2H），7.42（m，4H），7.28（m，6H）.IR（KBr，cm-1）：，1 563，1 476，1 432，199，1 018（vPh—S），826，769，730（δC—H）.

配體L2的合成：稱(chēng)取配體L10.40g（1mmol），硼氫化鈉0.10g（2.5mmol），溶于25mL甲醇中，加熱回流4h，將產(chǎn)物濃縮至干，用乙醚多次洗滌，真空干燥，得淺黃色固體粉末0.33g，產(chǎn)率82.9%.分子式C24H22N4S.元素分析實(shí)驗(yàn)值（%）：C 72.39，H 5.49，N 14.11；計(jì)算值：C 72.36，H 5.53，N 14.07.1H NMR（300MHz，CDCl3）：8.57（d，J＝4.3Hz，2H），7.64（t，J＝7.6Hz，2H），7.36（m，4H），7.11（d，4H），6.58（d，J＝8.4Hz，4H），4.85（s，2H），4.43（s，4H）.IR（KBr，cm-1）：3 378（vN—H），1 596，1 499，1 426，1 316（vC■C，vC■N，vC—N），1 083，1 043（vPh—S），823，752（δC—H）.

圖2 配體及配合物的合成路線(xiàn)Fig.2 Synthesis of the ligand and Ru complexes

配合物Ru1的合成：稱(chēng)取0.52g（1mmol）二水合二氯二聯(lián)吡啶釕，0.35g（2.1mmol）硝酸銀于250mL燒瓶中，加入100mL乙醇溶解，加熱回流2 h，趁熱過(guò)濾，除去氯化銀沉淀，得到紅棕色溶液。稱(chēng)取0.4g（1.0mmol）配體L1于250mL燒瓶中，將所得到的濾液加入燒瓶中，溶液在N2保護(hù)下回流12h.反應(yīng)結(jié)束后，將溶液濃縮除去大量溶劑，將產(chǎn)物倒出，加入少量飽和高氯酸鈉乙醇溶液，產(chǎn)物逐漸沉降出來(lái)，過(guò)濾，用乙醚洗滌，真空干燥。所得固體用少量的乙腈溶解，以乙腈和水混合溶劑作為洗脫劑（體積比24∶1），氧化鋁裝柱進(jìn)行柱分離，將收集的產(chǎn)物濃縮至干，真空干燥后，得棕色固體粉末0.31g，產(chǎn)率62.5%.配合物 Ru1的分子式為C44H34Cl2N8O8RuS.元素分析實(shí)驗(yàn)值（%）：C 52.51，H 3.35，N 11.15，計(jì)算值：C 52.49，H 3.38，N 11.13.1H NMR（300MHz，DMSO-d6）：8.88（d，4H），8.79～8.74（m，6H），8.60～8.19（d，8H），7.99～7.64（t，6H），7.50（s，1H），7.30（d，4H），7.03～6.62（m，5H）.IR（KBr，cm-1）：1 627（vC■N），1 593，1 441（vC■C，vC■N），766，622（δC—H），1 092（vCl—O）.ESI-MS（m／z）：計(jì)算值為403.500 0，實(shí)際測(cè)得值為404.300 0，此峰歸屬為Ru12＋.

配合物Ru2的合成：合成方法及步驟同Ru1，換用配體L20.21g（0.5mmol）代替 L1，得到紅褐色固體0.26g，產(chǎn)率51.4%.配合物Ru2的分子式為C44H38Cl2N8O8RuS.元素分析實(shí)驗(yàn)值（%）：C 52.25，H 3.75，N 11.12，計(jì)算值：C 52.28，H 3.76，N 11.09.1H NMR（300MHz，DMSO-d6）：8.85（d，4H），8.60～8.36（m，6H），8.24～8.09（m，4H），7.93～7.74（dd，J＝17.8，11.8Hz，6H），7.66～7.46（m，3H），7.28（t，J＝12.2，10.8Hz，4H），7.01（d，J＝8.5Hz，4H），6.50（d，J＝8.6Hz，4H），4.32（d，J＝3.8Hz，3H）.IR（KBr，cm-1）：1 596，1 502，1 435（vC■C，vC■N），758，625（vC—H），1 086（vCl—O）.ESI-MS（m／z）：計(jì)算值為406.100 0，實(shí)際測(cè)得值為405.000 0，此峰屬于Ru22＋.

1.3 生物活性檢測(cè)

按照標(biāo)準(zhǔn)的 MTT測(cè)試方法［18-19］進(jìn)行檢測(cè)，概括為4步：

1）種入細(xì)胞。在96孔板的3～11列用排槍分別加入懸有細(xì)胞的200μL培養(yǎng)基，使每孔細(xì)胞數(shù)大約為10 000個(gè)，第2列作為溶劑空白，96孔板周?chē)优囵B(yǎng)基防止揮發(fā)。將96孔板放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中過(guò)夜，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待80%細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行下一步。

2）加藥。在24孔板的每個(gè)孔中各加入3mL培養(yǎng)基，將所加藥物稀釋到不同濃度梯度，用排槍將孔中原有的培養(yǎng)液吸掉，每一列加入相同濃度的藥物，加完后，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。

3）加 MTT.在藥物與細(xì)胞相互作用結(jié)束前4h，吸掉培養(yǎng)液，用緩沖溶液PBS洗滌兩次，然后每孔加入180μL PBS緩沖溶液，再加入20μL 5mg／mL的MTT，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h.

4）加DMSO.4h后拿出96孔板，吸掉上清液，每孔加入150μL DMSO，放入搖床內(nèi)搖10min，將紫色結(jié)晶物充分溶解，放入酶標(biāo)儀卡槽內(nèi)在490 nm波長(zhǎng)處掃描，得到吸光度值（OD值）。吸光度值可以間接的反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量，以此來(lái)計(jì)算IC50值：

IC50＝OD（實(shí)驗(yàn)組）／OD（對(duì)照組）. （1）

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測(cè)Ru1誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡使用的熒光探針是Annexin V-FITC和PI.Ru1處理MCF-7細(xì)胞24h，同時(shí)做一個(gè)Ru1未處理的MCF-7細(xì)胞作對(duì)照，分別收集細(xì)胞數(shù)目達(dá)到105個(gè)，用滅菌PBS緩沖液洗滌一次后，每管加入500μL試劑盒中的結(jié)合緩沖液并重懸細(xì)胞。每管分別加10μL PI染液和5μL Annexin V-FITC染液，避光染色5 min，使用EPICS XL-MCL型流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，使用488nm分別激發(fā)出FITC的綠光和PI的紅光。樣品上儀器前用200目濾網(wǎng)過(guò)濾雜質(zhì)以免堵塞機(jī)器。使用儀器自帶的EXPO32MultiComp（Beckman Coulter）軟件自動(dòng)擬合出各時(shí)期細(xì)胞凋亡率和壞死率。

1.5 Hoechst 33258染色測(cè)定細(xì)胞凋亡

蓋玻片放入6孔板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜，大約50%～80%鋪滿(mǎn)細(xì)胞。用各個(gè)濃度的藥物（5，10，25 μmol／L）處理細(xì)胞24h，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5mL含4%多聚甲醛或70%乙醇的固定液，固定10min或者更長(zhǎng)時(shí)間。棄掉固定液，用PBS洗兩遍，每次3 min，吸盡液體。加入1mL 10μg／mL的 Hoechst33258染色液，37℃染色15min.棄去染色液，用PBS洗兩遍，每次3min，吸盡液體。熒光顯微鏡下用紫外光激發(fā)，可觀察到呈藍(lán)色的細(xì)胞核，根據(jù)細(xì)胞核是否皺縮來(lái)判斷細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 配體及配合物的合成

配體及配合物是按照相關(guān)文獻(xiàn)合成的［20］，為了確定配體及配合物的結(jié)構(gòu)，在CDCl3和DMSO-d6溶劑里做了核磁氫譜。以配體L1為例（如圖3），8.72處為吡啶環(huán)上H6的峰，該峰屬于雙重峰，由于受鄰位氮原子的吸電子效應(yīng)影響，使得吡啶環(huán)中該氫的化學(xué)位移最大；8.61處為希夫堿—CHN—上H5的峰，該峰是一個(gè)強(qiáng)的單峰，由此可判斷配體中形成了希夫堿鍵；8.20處為吡啶環(huán)上H4的雙重峰；7.82處為吡啶環(huán)中 H3的三重峰；7.42處的峰屬于苯環(huán)上H2的峰，為雙重峰；7.28處為多重峰，此多重峰歸屬于苯環(huán)上的H1及吡啶環(huán)上的H1.苯環(huán)上H2的峰相比H1移向低場(chǎng)，由于H2受希夫堿鍵吸電子效應(yīng)的影響，使得去屏蔽作用增強(qiáng)，所以移向低場(chǎng)。同樣L2和Ru1、Ru2也分別在CDCl3和DMSO-d6溶劑里做了核磁氫譜，很明顯L2配體的1H NMR中8.61×10-6附近的單峰消失了，說(shuō)明希夫堿鍵被還原為單鍵。對(duì)配合物來(lái)說(shuō)，因其分子中苯環(huán)較多，氫化學(xué)環(huán)境相差不大，使得峰相互疊加，難以一一指認(rèn)。但是測(cè)得的圖譜中總氫的個(gè)數(shù)與化學(xué)結(jié)構(gòu)式中氫的個(gè)數(shù)一致。說(shuō)明配體和配合物在溶液里能穩(wěn)定存在。

圖3 配體L1在CDCl3中的核磁氫譜Fig.3 1 H NMR of ligand L1 in CDCl3

2.2 光譜性質(zhì)

將配合物配制成濃度為1.0×10-5mol／L的乙腈溶液，測(cè)試配合物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，如圖4所示。配合物Ru1在254，286和487nm處有三個(gè)吸收峰，而配合物Ru2在278和484nm處有兩個(gè)吸收峰。其中254，286和278nm三個(gè)峰屬于配體內(nèi)π-π＊躍遷產(chǎn)生的吸收峰；487和484nm處的吸收峰屬于金屬到配體的電荷轉(zhuǎn)移吸收峰（MLCT），相比［Ru（bpy）3］2＋（λmax＝451nm）發(fā)生了略微的紅移，說(shuō)明所合成的配合物共軛體系比［Ru（bpy）3］2＋大［21-22］。

圖4 Ru1和Ru2在乙腈中的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig.4 UV-Vis spectra of complexes Ru1and Ru2（1×10-5 mol／L）in acetonitrile

2.3 電化學(xué)性質(zhì)

將 Ru1和 Ru2分別溶解在0.1mol／L的Bu4NClO4的乙腈溶液中配制成一定濃度（1.0×10-3mol／L）的溶液，以鉑電極為工作電極和對(duì)電極，飽和甘汞電極（SCE）作為參比電極，組成簡(jiǎn)單的三電極體系通過(guò)微分脈沖極譜法測(cè)試配合物的氧化還原電位，得到微分脈沖極譜曲線(xiàn)（DPV），如圖5所示。從圖5可以看出，兩個(gè)配合物在0～1.5V范圍內(nèi)均有兩個(gè)氧化峰，而配體在0～1.5V范圍內(nèi)沒(méi)有氧化峰，說(shuō)明這兩個(gè)峰是金屬中心的氧化峰，分別對(duì)應(yīng)于Ru2＋→Ru3＋→Ru4＋.

圖5 Ru1和Ru2在乙腈中的微分脈沖極譜曲線(xiàn)Fig.5 Differential pulse voltammetry studies of Ru1and Ru2in acetonitrile

2.4 生物活性檢測(cè)

通過(guò)MTT方法檢測(cè)配合物對(duì)Hela（人宮頸癌細(xì)胞）、BGC823（胃癌細(xì)胞）和 MCF-7（乳腺癌細(xì)胞）的細(xì)胞毒性。作出Ru1和Ru2對(duì)三種腫瘤細(xì)胞作用48h后的濃度-存活率曲線(xiàn)圖。圖6顯示了Ru1和Ru2對(duì)Hela、BGC823和MCF-7的細(xì)胞毒性結(jié)果。從表1和圖6可以看出，對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞，Ru1的IC50值都比Ru2小，說(shuō)明Ru1的抗腫瘤活性大于Ru2.而對(duì)所測(cè)的三種細(xì)胞，Ru1和Ru2均對(duì)MCF-7的IC50值最小，說(shuō)明兩個(gè)配合物對(duì) MCF-7有比較好的選擇性，可能成為潛在的抗癌藥物。機(jī)理可能是配合物的溶解度低，疏水性強(qiáng)，親脂性大，使得配合物容易累積到線(xiàn)粒體內(nèi)。釕配合物作為抗腫瘤藥物的具體機(jī)理還在進(jìn)一步研究中。

圖6 Ru1和Ru2對(duì)腫瘤細(xì)胞的濃度-存活率曲線(xiàn)圖Fig.6 Cell viability of Ru1and Ru2toward proliferation of Hela，BGC823and MCF-7

表1 Ru1和Ru2的IC50值Table 1 IC50of Ru1and Ru2

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

Annexin-V FITC和PI兩種熒光試劑雙染Ru1處理24h后的MCF-7細(xì)胞，再結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)處于各種狀態(tài)的細(xì)胞（正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、中晚期凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞）的比例。圖7所示是Ru1處理過(guò)的MCF-7細(xì)胞。當(dāng)Ru1處理細(xì)胞24h后，對(duì)照組中正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞的比例分別為93.67%和2.58%.當(dāng)用5，10和25μmol／L的Ru1處理后，早期凋亡細(xì)胞的比例分別為3.11%，4.22%和12.44%.明顯可以看出，隨著配合物濃度的增大，早期凋亡細(xì)胞所占比例逐漸增大，說(shuō)明Ru1會(huì)誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡而不是壞死。

圖7 MCF-7細(xì)胞中正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的比例Fig.7 Percentage of living（B3），necrotic（B2），and apoptotic（B4）MCF-7cells

2.6 Hoechst染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

Hoechst是一種熒光染料，它的膜通透性很好，正常細(xì)胞和早中期凋亡的細(xì)胞可以被Hoechst著色。正常細(xì)胞核被它染色后的形態(tài)是圓形，淡藍(lán)色，里面有較深的藍(lán)色顆粒，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核由于濃集而呈亮藍(lán)色，或呈分葉、碎片、邊集狀態(tài)。MCF-7細(xì)胞經(jīng)5，10和25μmol／L的Ru1作用24h后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。從圖8可見(jiàn)，對(duì)照組的細(xì)胞呈正常結(jié)構(gòu)，沒(méi)有觀察到細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝聚和塊狀熒光等現(xiàn)象，而配合物作用后的細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝聚，部分呈月牙形附于核膜周?chē)?，并且隨著配合物濃度的增大，這種不正常的細(xì)胞比例逐漸增大，說(shuō)明Ru1誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。

圖8 熒光顯微鏡觀察Hoechst33258染色MCF-7細(xì)胞Fig.8 Hoechst 33258staining of MCF-7cells

3 結(jié)論

本文以4，4′-二氨基二苯硫醚和2-吡啶甲醛為原料，合成了兩個(gè)配體，并在此基礎(chǔ)上合成了兩個(gè)單核釕配合物。通過(guò)元素分析、核磁氫譜、紅外光譜、電噴霧質(zhì)譜對(duì)配體及配合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，證實(shí)了配合物結(jié)構(gòu)的正確性。此外，研究了配合物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜和電化學(xué)性質(zhì)。通過(guò)MTT法測(cè)試了Ru1和Ru2對(duì)Hela、BGC823和MCF-7三種腫瘤細(xì)胞的抗癌活性。結(jié)果顯示：Ru1的抗腫瘤活性強(qiáng)于Ru2，說(shuō)明含有希夫堿結(jié)構(gòu)的配合物與腫瘤細(xì)胞作用較強(qiáng)。而在所測(cè)的三種細(xì)胞中，Ru1和Ru2均表現(xiàn)出對(duì)MCF-7有很好的選擇性，說(shuō)明Ru1和Ru2可能成為治療癌癥的潛在藥物。最后通過(guò)熒光染色法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)配合物Ru1對(duì)MCF-7的細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ru1誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。