吳烜 童剛領(lǐng) 程勃然 余少康 王樹濱

【摘要】 目的 探討膜潛伏蛋白2A（LMP2A）調(diào)節(jié)EB病毒（EBV）相關(guān)胃癌（EBVaGC）細胞中程序性死亡蛋白-配體1（PD-L1）的表達， 并分析LMP2A和PD-L1在胃癌細胞株中的表達及關(guān)系。方法 選取人胃癌細胞株SNU-719[EBV陽性（EBV+）]、AGS[EBV陰性（EBV-）]， 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng) （qRT-PCR）方法檢測胃癌細胞株SNU-719（EBV+）及AGS（EBV-）中LMP2A和PD-L1基因的表達水平， 佛波醇（TPA） 誘導SNU-719（EBV+）和AGS（EBV-）中LMP2A的表達后， 蛋白質(zhì)印跡法（WB）檢測LMP2A、PD-L1蛋白表達水平的變化。結(jié)果 PD-L1在EBV陽性細胞株SNU-719（EBV+）中的表達水平明顯高于在AGS（EBV-）中的表達水平， 差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。SNU-719（EBV+）中LMP2A mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于AGS（EBV-）細胞株， 差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;AGS（EBV-）、SNU-719（EBV+）細胞株中PD-L1和LMP2A mRNA轉(zhuǎn)錄水平具有一致性。誘導12、24、48 h， LMP2A在SNU-719（EBV+）細胞株中表達呈上升趨勢， 而AGS（EBV-）細胞株無變化。TPA誘導12 h后， SNU-719（EBV+）細胞PD-L1表達明顯升高， 而AGS（EBV-）細胞株升高不明顯。結(jié)論 EBV相關(guān)胃癌可能通過LMP2A介導的致癌途徑上調(diào)PD-L1表達， 從而引起腫瘤免疫逃逸。這提示阻斷LMP2A致癌途徑和PD-1/PD-L1檢查點抑制通路可為EBV感染的胃癌患者帶來潛在臨床益處。

【關(guān)鍵詞】 EB病毒相關(guān)胃癌;膜潛伏蛋白2A;程序性死亡蛋白-配體1;免疫治療

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.24.087

【Abstract】 Objective? ?To discuss the expression of programmed death protein ligand 1 （PD-L1） in EB virus associated gastric cancer （EBVaGC） cells by latent membrane protein 2A （LMP2A）， and analyze the expression and correlation between LMP2A and PD-L1. Methods? ?Human gastric cancer cell lines SNU-719 [EBV positive （EBV+）] and AGS [EBV negative （EBV-）] were selected. Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） was used to detect the expression of LMP2A and PD-L1 in gastric cancer cell line SNU-719 （EBV+） and AGS （EBV-）. Then the cells were induced with phorbol-12-tetradecanoate-13-acetate （TPA）， Western blotting （WB） was used to detect the expression levels of LMP2A and PD-L1. Results? ?The expression level of PD-L1 in EBV positive cell line SNU-719 （EBV+） was significantly higher than that in AGS （EBV-）， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The transcription level of LMP2A mRNA in SNU-719 （EBV+） was significantly higher than that in AGS （EBV-） cell lines， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The transcription levels of PD-L1 and LMP2A mRNA in AGS （EBV-） and SNU-719 （EBV+） cell lines were consistent. At 12， 24， and 48 h after induction， the expression of LMP2A in SNU-719 （EBV+） cell line showed an upward trend， while the expression of AGS （EBV-） cell line remained unchanged. After 12 h of TPA induction， the expression of PD-L1 in SNU-719 （EBV+） cells was significantly increased， while that of AGS （EBV-） cell lines was not significantly increased. Conclusion? ?EBV associated gastric cancer may upregulate the expression of PD-L1 through LMP2A-mediated carcinogenic pathway， resulting in tumor immune escape. These findings indicated that simultaneous inhibition of PD-1/PD-L1 and LMP2A may provide potential survival benefits to patients with EBV associated gastric cancer.

【Key words】 EB virus associated gastric cancer; Latent membrane protein 2A; Programmed death protein ligand 1; Immunotherapy

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。在我國， 胃癌的發(fā)病率和病死率居高不下， 位居我國惡性腫瘤發(fā)病率為第2位， 死亡率位居第3位， 發(fā)患者數(shù)及死亡人數(shù)均占全球胃癌發(fā)病總例數(shù)的50%左右[1， 2]。盡管早期胃癌的治療預后較好， 5年無病生存達70%以上， 然而臨床Ⅲ～Ⅳ期患者在綜合治療后仍容易復發(fā)和轉(zhuǎn)移， 復發(fā)、轉(zhuǎn)移性胃癌中位生存時間只有9～10個月[3]。除了20%的胃癌患者具有人表皮生長因子受體-2（HER-2）擴增可以應(yīng)用靶向治療外， 其他類型的胃癌目前尚缺少明確有效的靶向藥物， 臨床急需探索新的高效、低毒的藥物。2014年， 癌癥基因組圖譜計劃的研究者將胃癌分為4種基因亞型[4]， 其中一類亞型為EB病毒（epstein-barr virus， EBV）陽性胃癌也稱EBVaGC， 根據(jù)既往研究報道， 全球范圍內(nèi)EBVaGC發(fā)病率為3.3%～26.3%， 其中以東亞占比最多[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)EBVaGC有一個非常明顯的病理特征：癌細胞周圍浸潤了大量的淋巴細胞， 但是并不能識別及清除癌細胞， 呈現(xiàn)典型的腫瘤免疫逃逸狀態(tài)[6]。分子研究顯示， EBV潛伏感染及其產(chǎn)生的潛伏期蛋白LMP2A是EBVaGC發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化及免疫逃逸的主要原因之一[7]。進一步研究發(fā)現(xiàn)， 免疫負性調(diào)節(jié)蛋白PD-L1在EBVaGC組織中亦有廣泛表達[8]， 提示PD-L1/2拮抗劑可能成為此型胃癌患者的治療新選擇。目前， 關(guān)于LMP2A及PD-L1相關(guān)性未有文獻報道。因此， 本研究擬于體外研究中探討EBVaGC中PD-L1與LMP2A的表達情況， 并探討其之間相互作用關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 細胞株 人胃癌細胞株SNU719（EBV+）、AGS（EBV-）由香港中文大學腫瘤學系李晨博士贈予。

1. 2 材料與試劑 總RNA提取試劑盒、qRT-PCR試劑、Lipofectamine 2000、胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、β-actin對照單克隆抗體購于承啟醫(yī)學（深圳）科技有限公司;TPA佛波醇購于上海生工;Anti-PD-L1抗體、Anti-EBV LMP2A抗體購于深圳市億立方生物技術(shù)有限公司。

1. 3 實驗方法

1. 3. 1 細胞培養(yǎng)、TPA誘導LMP2A表達 SNU719（EBV+）、AGS（EBV-）在含10%胎牛血清和抗生素（10000 U/ml青霉素和10 μg/ml鏈霉素）的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 置于37℃、5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中。TPA誘導LMP2A在胃癌細胞株SNU-719（EBV+）和AGS（EBV-）中的表達， 誘導時間分別為12 h、24 h、48 h。

1. 3. 2 qRT-PCR檢測胃癌細胞株中LMP2A及PD-L1 mRNA表達水平 采用總RNA提取試劑盒進行RNA提取， 純度合格后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計引物：PD-L1上游引物CCAGTCACCTCTGAACATGAA， 下游引物ATTGGTGGTGGTGGTCTTAC;LMP2A上游引物ATGACTCATCTCAACACATA， 下游引物CATGTTAGGCAAATTGCAAA。

1. 3. 3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting， WB）檢測PD-L1、LMP2A蛋白表達情況 按蛋白提取試劑盒說明提取總蛋白， 高溫變性。樣品SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜， 用5%milk/PBST室溫封閉1 h后孵育一抗[anti-PD-L1（1∶500）、anti-LMP2A（1∶500）]， 4℃冰箱過夜。將PVDF膜放入用5%milk/PBST稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗中， 室溫搖床孵育1 h。顯影后用Image J軟件分析蛋白條帶灰度， 以目的蛋白/內(nèi)參蛋白灰度值進行分析。

1. 4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2. 1 PD-L1在AGS（EBV-）及SNU-719（EBV+）細胞株中的表達 PD-L1在EBV陽性細胞株SNU-719（EBV+）中的表達水平明顯高于在AGS（EBV-）中的表達水平， 差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1。

2. 2 PD-L1、LMP2A mRNA在AGS（EBV-）及SNU-719（EBV+）細胞株中的表達 SNU-719（EBV+）中LMP2A mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于AGS（EBV-）細胞株， 差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;AGS（EBV-）、SNU-719（EBV+）細胞株中PD-L1和LMP2A mRNA轉(zhuǎn)錄水平具有一致性。見圖2。

2. 3 TPA誘導后PD-L1、LMP2A在AGS（EBV-）及SNU-719（EBV+）細胞株中的表達 誘導12、24、48 h， LMP2A在SNU-719（EBV+）細胞株中表達呈上升趨勢， 而AGS（EBV-）細胞株無變化。TPA誘導12 h后， SNU-719（EBV+）細胞PD-L1表達明顯升高， 而AGS（EBV-）細胞株升高不明顯。見圖3。

3 討論

腫瘤的治療已經(jīng)進入了免疫治療的時代。然而不同于黑色素瘤、肺癌等免疫原性較強的腫瘤， 胃癌免疫原性相對較弱， 異質(zhì)性較高， 總體來說， 免疫治療在胃癌有效率并不高， 找到適合免疫治療的胃癌亞群尤為重要。EBVaGC是胃癌中一特殊亞型， 病理表現(xiàn)為花斑狀， 腫瘤周圍有免疫細胞浸潤， 而癌細胞最終可以逃避宿主的免疫消除并繼續(xù)生長， 分子研究顯示其伴隨JAK2、PD-L1與PD-L2基因的擴增[7]， 提示該亞型存在著腫瘤微環(huán)境免疫抑制并可能成為靶向免疫檢查點治療的潛在人群。然而， 目前對于EBVaGC中PD-L1調(diào)節(jié)的潛在機制及其臨床意義仍然知之甚少。在本研究中， 胃癌細胞株中PD-L1的表達（無論是在蛋白水平還是在mRNA水平）都與EBV感染呈正相關(guān)。這一結(jié)果與既往一些病毒相關(guān)癌癥的研究相似， 如EBV相關(guān)淋巴瘤[9]以及流行區(qū)的EBV相關(guān)鼻咽癌[10]， HBV相關(guān)肝細胞癌[11]中亦發(fā)現(xiàn)PD-L1表達的上調(diào)。而其他病原體， 如幽門螺桿菌， 也被報道能誘導胃癌細胞系PD-L1的表達[12]。這些研究表明， 感染相關(guān)的腫瘤可以通過上調(diào)PD-L1來創(chuàng)造一個“免疫豁免”的環(huán)境。因此， 靶向PD-L1/PD1通路以阻斷免疫抑制可成為該類腫瘤的重要治療策略。近期韓國一項研究對61例接受PD-1抑制劑pembrolizumab的轉(zhuǎn)移性胃癌患者進行了療效分析和基因檢測， 結(jié)果顯示， EBV陽性的患者有效率為100%[13]， 為最特異的療效相關(guān)指標。

本研究進一步探討了EBV感染鼻咽癌中PD-L1上調(diào)的可能機制。既往研究表明， 致癌驅(qū)動基因可上調(diào)PD-L1， 引起腫瘤免疫逃逸， 有報道， 在非小細胞肺癌（NSCLC）中， 致癌的EGFR信號通路可能觸發(fā)PD-L1的表達， 從而導致免疫耐受[14]。而以往研究也表明， EBV主要致癌基因LMP1可通過激活STAT3、AP-1、 NF-κB通路介導鼻咽癌中PD-L1的上調(diào)[15]。胃癌中， LMP2A在一半以上的EBVaGC中表達， 與致癌途徑的啟動相關(guān)。本研究中， PD-L1在EBV（+）細胞系中的表達與LMP2A呈正相關(guān)， 此外還發(fā)現(xiàn)， 通過外源性誘導LMP2A過表達， 能顯著增加PD-L1的表達。因此， LMP2A參與激活的致癌途徑至少是EBV相關(guān)胃癌PD-L1上調(diào)的部分原因。LMP2A這一新發(fā)現(xiàn)的功能可能為EBV驅(qū)動的胃癌的免疫逃逸和腫瘤發(fā)生提供新的見解。本研究同時也存在一定的局限性：①未能進一步探索LMP2A驅(qū)動PDL1表達的分子機制;②其結(jié)果基于體外研究， 有待體內(nèi)模型及更多基礎(chǔ)研究進一步驗證。

綜上所述， EBVaGC可能通過LMP2A介導的致癌途徑上調(diào)PD-L1表達， 從而引起腫瘤免疫逃逸， 有利于理解EBV介導的腫瘤生成及免疫逃逸機制， 有助于臨床更好的篩選接受免疫治療的胃癌人群， 從而擴大治療獲益;同時也提示阻斷LMP2A致癌途徑和PD-1/PD-L1檢查點抑制通路可為EBV感染的胃癌患者帶來潛在臨床益處。

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[收稿日期：2020-05-06]