（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽外科，陜西 西安 710061）

據(jù)全球癌癥統(tǒng)計報告分析，2018年全球新增肝癌患者841 080 例，死亡781 631 例，有近半數(shù)患者來自中國[1]，因此我國肝癌的防治形勢十分嚴(yán)峻。肝細(xì)胞癌是我國常見的肝癌病理類型，早期確診率較低，進(jìn)入中晚期后由于患者基礎(chǔ)狀況差、缺乏手術(shù)指征，導(dǎo)致5年生存率低[2]。分子靶向制劑的出現(xiàn)為中晚期肝細(xì)胞癌患者帶來了希望。索拉非尼是一類多激酶、多靶點(diǎn)抑制劑，可靶向抑制Raf 激酶、酪氨酸激酶、絲氨酸/蘇氨酸激酶等[3]。全球多項臨床試驗均證實索拉非尼作為晚期肝癌的一線用藥，可明顯延長患者的生存期[4]。但是長期大量用藥導(dǎo)致患者耐受性降低，從而影響預(yù)后，因此如何提高腫瘤細(xì)胞對索拉非尼的反應(yīng)性是醫(yī)學(xué)界最新關(guān)注的熱點(diǎn)。2016年，SUN 等[5]學(xué)者在權(quán)威雜志《Hepatology》上發(fā)表了1 篇文章，發(fā)現(xiàn)MT1G 通過抑制鐵死亡，促使肝細(xì)胞癌對索拉非尼產(chǎn)生耐藥性。MT1G 是一類具有高度保守結(jié)構(gòu)的小分子蛋白質(zhì)，通過與金屬離子結(jié)合，誘導(dǎo)金屬應(yīng)答元件，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[6]。SUN 等[5]在文章中提出，索拉非尼可通過誘導(dǎo)一類新的細(xì)胞死亡途徑——“鐵死亡”發(fā)揮肝細(xì)胞癌殺傷作用，而MT1G 是“鐵死亡”過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白。目前關(guān)于MT1G 與肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系報道較少，TCGA 數(shù)據(jù)庫為尋找有價值的基因提供了重要線索。在本研究首先在TCGA在線數(shù)據(jù)庫中查詢了MT1G 在肝癌組織中的表達(dá)及與患者生存期的關(guān)系，以此為基礎(chǔ)，納入在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診，行索拉非尼治療的中晚期肝細(xì)胞癌患者作為實驗對象，進(jìn)一步分析MT1G 與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征及索拉非尼治療反應(yīng)性的關(guān)系，為深入了解肝細(xì)胞癌對索拉非尼的耐藥機(jī)制提供一定的循證醫(yī)學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析MT1G 在肝癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

利用TCGA 在線網(wǎng)站（http：//ualcan.path.uab.edu/analysis.html）檢索MT1G 在肝癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系。

1.2 標(biāo)本收集

調(diào)取在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理室保存的86 例病理組織蠟塊，包括癌組織和相配對的癌旁組織（距離肝細(xì)胞癌組織＞2 cm）。所有蠟塊來自2016年11月—2018年5月在本院接受肝切除術(shù)的中晚期肝細(xì)胞癌患者。其中，男性75 例，女性11 例；年齡34～81 歲，平均（61.17±12.54）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合手術(shù)指征，并手術(shù)切除；②術(shù)中發(fā)現(xiàn)或術(shù)后經(jīng)病理證實為中晚期肝細(xì)胞癌；③符合巴塞羅那肝癌分期（BCLC）B 或C 期，肝功能Child-Pugh 分級為A 或B 級；④術(shù)后經(jīng)影像學(xué)檢查未見確切殘留病灶；⑤術(shù)后接受索拉非尼治療，且確定治療前無復(fù)發(fā)；⑥術(shù)前未經(jīng)放化療及其他系統(tǒng)地抗腫瘤治療；⑦預(yù)計生存時間≥3 個月。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他重要器官功能障礙。本研究中所有病理標(biāo)本的獲取已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審核。

1.3 主要試劑及儀器

Envision 二步法試劑盒（美國Dako 公司），MT1G抗體（英國Abcam 公司），即用型二抗和DAB 試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），TIANamp FFPE DNA Kit（離心柱型）、甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（methylation specific polymerase chain reaction,MSP）試劑盒（北京天根生化科技有限公司），EpiTect Bisulfite Kit（德國Qiagen 公司），5331 型PCR 儀（美國Eppendorf 公司）。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測組織MT1G 蛋白

采用常規(guī)Envision 二步法檢測MT1G 蛋白在肝細(xì)胞癌組織和癌旁組織中的表達(dá)。取病理切片60℃烤箱烘烤2 h，依次用二甲苯（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ）和梯度酒精（無水酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精）各5 min 脫蠟水化，置于檸檬酸鈉緩沖液中加熱進(jìn)行組織抗原修復(fù)，滴加3% H2O2溶液封閉。滴加足量的MT1G 抗體（1 ∶100 稀釋），置于濕盒中4℃孵育過夜，洗滌。滴加即用型二抗，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，脫水，中性樹膠封片。室溫下干燥，由2 位以上病理科副主任醫(yī)師盲法閱片。結(jié)果判定：以胞漿出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒為陽性染色，少數(shù)陽性染色細(xì)胞也會出現(xiàn)細(xì)胞核著色。胞漿或胞核未出現(xiàn)棕黃色染色則為陰性。

1.5 MSP 檢測MT1G 基因啟動子甲基化狀態(tài)

采用石蠟包埋組織DNA 提取試劑盒（離心柱型）提取肝細(xì)胞癌組織DNA，用紫外分光光度計測定DNA 樣本的純度和濃度。取2.0μg DNA 樣本，進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾和純化。取2.0μl 純化后回收的DNA 樣本進(jìn)行MSP 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火60 s，72℃延伸20 s，共計36 個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min，4℃保存。最后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。MSP 引物序列見表1。

表1 MSP 引物序列

1.6 治療及隨訪

所有患者接受外科手術(shù)，在切除腫瘤的同時，根據(jù)癌栓位置取栓，術(shù)中若發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移則行淋巴結(jié)清掃。術(shù)后經(jīng)主治醫(yī)生評估接受索拉非尼治療。甲苯磺酸索拉非尼片（商品名：多吉美，德國拜耳醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：200 mg，注冊證號：H20160201）初始口服劑量400 mg/次，2 次/d。因毒副作用酌情減量，發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展、復(fù)發(fā)、患者不耐受藥物不良反應(yīng)或死亡時停藥。結(jié)合復(fù)診病歷或電話對患者或家屬進(jìn)行隨訪，隨訪時間截至2019年11月。主要研究終點(diǎn)為患者停藥時間，次要研究終點(diǎn)為患者總生存期。疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)時間為患者手術(shù)至CT 或MRI 檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時間?？偵嫫跒榛颊呤中g(shù)至患者死亡或隨訪截止時間。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，比較用秩和檢驗；計數(shù)資料以以率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關(guān)性分析用Spearman 法；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析

檢索TCGA 數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，371 例原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織[5 087.62（2 311.54，11 857.47）]和相配對的癌旁正常肝臟組織[40.21（16.54，986.4）]中MT1G 蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=6 579.571，P=0.000），原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織低于癌旁正常肝臟組織（見圖1）。另外MT1G 蛋白高表達(dá)者和低表達(dá)者總生存率分別為13.19%（12/91）和23.72%（65/274），中位生存時間分別為55.0 個月（1.0～117.0 個月）和56.0 個月（1.0～120.0 個月），經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.485，P=0.872）（見圖2）。

圖1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織與癌旁正常肝臟組織的MT1G 蛋白相對表達(dá)量比較 （n=371）

2.2 MT1G 蛋白在肝細(xì)胞癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

經(jīng)免疫組織化學(xué)法檢測，86 例肝細(xì)胞癌組織樣本和癌旁組織中MT1G 蛋白陽性表達(dá)率分別為34.88%（30/86）和65.51%（56/86），經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15.956，P=0.000），肝細(xì)胞癌組織低于癌旁組織。見圖3。

圖2 TCGA 數(shù)據(jù)庫中不同MT1G 蛋白表達(dá)水平患者的預(yù)后

圖3 MT1G 蛋白在肝細(xì)胞癌組織和癌旁組織中的表達(dá)（免疫組織化學(xué)法×200）

2.3 MT1G 基因啟動子甲基化檢測

經(jīng)MCP 檢測，肝細(xì)胞癌組織和癌旁組織MT1G基因啟動子甲基化率分別為60.46%（52/86）和37.21%（32/86），經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.307，P=0.002），肝細(xì)胞癌組織高于癌旁組織。見圖4。

圖4 MT1G 基因啟動子甲基化狀態(tài)

2.4 MT1G 蛋白陽性表達(dá)與MT1G 基因啟動子甲基化狀態(tài)的關(guān)系

經(jīng)等級相關(guān)性分析，MT1G 蛋白陽性表達(dá)率與MT1G 基因啟動子甲基化率呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.787，P=0.000）。

2.5 肝細(xì)胞癌組織中MT1G 蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

不同Child-Pugh 分級、BCLC 分期和術(shù)前血清甲胎蛋白的肝細(xì)胞癌患者腫瘤組織中MT1G 蛋白陽性表達(dá)率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而不同性別、年齡、肝炎背景、肝硬化病史、腫瘤數(shù)目和直徑、手術(shù)切除肝段的肝細(xì)胞癌患者腫瘤組織中MT1G 蛋白陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征肝細(xì)胞癌患者腫瘤組織中MT1G 蛋白陽性表達(dá)率比較 例（%）

2.6 肝細(xì)胞癌組織中MT1G 蛋白表達(dá)與索拉非尼停藥時間、生存時間的關(guān)系

所有患者在術(shù)后20.0 d（5～52 d）開始服用索拉非尼，中位服藥時間為17.0 個月（1.0～33.0 個月）。MT1G 蛋白陽性表達(dá)患者中位停藥時間為15.0 個月（4.0～27.0 個月），MT1G 蛋白陰性表達(dá)患者為20.0 個月（1.0～33.0 個月），經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.248，P=0.002），MT1G 蛋白陽性表達(dá)患者停藥時間較短。另外，中位隨訪時間為15.0 個月（4.0～40.0 個月）。見圖5。

圖5 MT1G 蛋白陽性與陰性表達(dá)患者的索拉非尼停藥時間比較

隨訪期間，39 例患者死亡，中位生存時間為25.0 個月（4.0～40.0 個月），總生存率為54.65%（47/86）。MT1G 蛋白陽性表達(dá)患者中位生存時間為20.0 個月（11.0～38.0 個月），MT1G 蛋白陰性表達(dá)患者為25.0 個月（4.0～40.0 個月），經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.717，P=0.190）。同時，MT1G 蛋白陽性表達(dá)患者和陰性表達(dá)患者總生存率分別為43.33%（13/30）和60.71%（34/56），經(jīng)χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.381，P=0.123）。見圖6。

圖6 MT1G 蛋白陽性與陰性表達(dá)患者的生存時間比較

3 討論

根據(jù)美國肝病學(xué)會診療指南和歐洲肝臟研究學(xué)會-歐洲癌癥研究治療組織臨床實踐指南推薦，對于BCLC 分期B、C 期肝癌患者建議實行肝動脈化療栓塞術(shù)以延長患者的生存時間[7]。但是在實際臨床中，部分中晚期患者具有良好的肝功能儲備，同樣可采取手術(shù)治療。TORZILLI 等[8]對2 046 例中晚期肝癌患者（BCLC 分期B 期737 例，C 期287 例）進(jìn)行術(shù)后隨訪，1年生存率約為70%。雖然手術(shù)治療提高了中晚期肝癌患者的1年生存期，但是術(shù)后高復(fù)發(fā)和高轉(zhuǎn)移率是導(dǎo)致治療失敗的主要原因。分子靶向制劑的出現(xiàn)為中晚期肝癌患者帶來了曙光。莊磊等[9]通過回顧性研究發(fā)現(xiàn)，中晚期肝癌患者術(shù)后使用索拉非尼可明顯延長中位生存時間，取得較為滿意的療效。但是國外一項Ⅲ期臨床試驗卻發(fā)現(xiàn)，索拉非尼在晚期肝癌患者的疾病控制率和總生存期方面獲益不明顯[10]。一方面與部分患者對索拉非尼反應(yīng)性較低有關(guān)；另一方面由于長期大劑量用藥，患者耐受性降低，易產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥。因此尋找可預(yù)測索拉非尼反應(yīng)性和耐藥性的敏感標(biāo)志物是提高患者臨床獲益的關(guān)鍵。

SUN 等[5]發(fā)現(xiàn)MT1G 作為一種重要的調(diào)節(jié)蛋白，有望成為索拉非尼治療肝細(xì)胞癌耐藥的新靶點(diǎn)。MT1G 屬于MT 家族成員之一，由61～81 個氨基酸序列組成，目前已知在肝臟組織和腎臟組織中的相對表達(dá)量最高，但是在其他組織中也有表達(dá)。本研究結(jié)果表明，MT1G 蛋白在肝細(xì)胞癌組織中呈低表達(dá)，而且與基因啟動子甲基化水平有關(guān)。因而筆者推測MT1G基因沉默可能與肝細(xì)胞癌的發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)。ZENG 等[11]通過細(xì)胞實驗也證實，肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B、Bel7402、SMMC7721、MHCC97L、HCC97H中MT1G 基因和蛋白相對表達(dá)量均明顯降低，上調(diào)MT1G基因表達(dá)后，可抑制肝癌細(xì)胞的增殖活性，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程有關(guān)，這與TCGA 數(shù)據(jù)庫中提供的數(shù)據(jù)基本一致。

進(jìn)一步分析MT1G 蛋白與中晚期肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果表明肝細(xì)胞癌組織中MT1G蛋白陽性表達(dá)率與Child-Pugh 分級、BCLC 分期、術(shù)前血清甲胎蛋白水平有關(guān)，筆者推測雖然MT1G基因啟動子發(fā)生甲基化是發(fā)生在細(xì)胞癌變的早期階段，但是MT1G不僅具有類癌基因的活性，屬于腫瘤生長抑制因子，還可能與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移也有一定的關(guān)系。JI 等[12]也曾證實，MT1G基因甲基化水平可作為篩查肝癌高?；颊叩拿舾兄笜?biāo)，特異性和敏感性分別為69.0%和83.8%，均高于血清甲胎蛋白的診斷效能，并且Ⅲ、Ⅳ期患者血清MT1G基因甲基化水平明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者。但是目前關(guān)于MT1G 抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步深入研究。

2012年，DIXON 等[13]首次提出“鐵死亡”的概念，與傳統(tǒng)的凋亡概念不同，“鐵死亡”是由于細(xì)胞內(nèi)鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物積累導(dǎo)致細(xì)胞收縮，線粒體膜密度升高，最終引起細(xì)胞死亡。YUAN 等[14]證實，沉默CISD1基因的表達(dá)，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體大量積累活性氧，進(jìn)而觸發(fā)肝細(xì)胞癌“鐵死亡”程序。2012年，CORIAT 等[15]發(fā)現(xiàn)索拉非尼通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，分泌活性氧，一方面發(fā)揮腫瘤細(xì)胞殺傷作用；另一方面易導(dǎo)致正常細(xì)胞內(nèi)聚集儲存鐵，產(chǎn)生毒副作用；而補(bǔ)充鐵螯合劑可降低索拉非尼毒副反應(yīng)的發(fā)生率。后來，SUN 等[5]研究證實，上述作用機(jī)制與細(xì)胞“鐵死亡”有關(guān)，屬于非激酶依賴性途徑，另外索拉非尼誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌鐵死亡的機(jī)制取決于MT1G基因甲基化狀態(tài)，上調(diào)MT1G基因表達(dá)，可增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)鐵死亡作用，從而提高治療的反應(yīng)性。本研究結(jié)果也表明，對于肝細(xì)胞癌組織MT1G 蛋白陽性表達(dá)者，中位生存時間明顯縮短，隨訪3年間總生存率也低于MT1G 蛋白陰性表達(dá)者，由于納入的樣本量偏少，最終并未得出統(tǒng)計學(xué)差異。

綜上所述，MT1G 蛋白在中晚期肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)降低，與MT1G基因啟動子過度甲基化有關(guān)。而且MT1G 是參與索拉非尼誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌細(xì)胞“鐵死亡”過程中的重要分子，MT1G 陽性表達(dá)的中晚期肝細(xì)胞癌患者接受索拉非尼治療獲益有限，相對陰性表達(dá)者預(yù)后不良，提示MT1G 有望成為肝細(xì)胞癌患者接受索拉非尼治療的潛在預(yù)后指標(biāo)，以及逆轉(zhuǎn)索拉非尼耐藥的重要分子靶點(diǎn)。但是目前關(guān)于“鐵死亡”的作用機(jī)制、索拉非尼與“鐵死亡”的關(guān)系，以及MT1G 在索拉非尼耐藥性中扮演的角色等問題尚不明確，需要更深入的基礎(chǔ)性研究以支持本文的結(jié)論。