（麗水市人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 麗水 323000）

胃癌的發(fā)生是一個涉及多階段、多因素、多通路的漸變過程，其中整合素在細(xì)胞異常增殖、胞外基質(zhì)降解，新生血管生成等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]。有研究顯示，整合素β1 在正常狀態(tài)下多處于低親和力狀態(tài)，但是在多種腫瘤組織中表達(dá)量升高[2]。也有體外研究證實，整合素β1 可調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞間的黏附作用，參與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程[3]。但是目前關(guān)于整合素β1 在胃癌發(fā)生中的激活機(jī)制尚不明確。Kindlin-2 蛋白屬于一類進(jìn)化上高度保守的整合素活化蛋白，可特異性結(jié)合整合素β1 受體，破壞α、β亞基間的鹽鍵，促進(jìn)整合素激活，影響細(xì)胞外基質(zhì)的黏附作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控[4]。其癌變的發(fā)生機(jī)制一直是腫瘤領(lǐng)域的研究重點，對臨床早期篩查和個體化治療具有重要的實踐意義。本研究選取慢性胃炎、胃癌癌前病變及胃癌患者作為受試對象，調(diào)查Kindlin-2 和整合素β1 在胃癌發(fā)生過程中的動態(tài)變化，從而為尋找用于早期胃癌診斷以及臨床進(jìn)展監(jiān)測的相關(guān)循環(huán)生物標(biāo)志物提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2019年1月在麗水市人民醫(yī)院消化內(nèi)科、腫瘤科就診的80 例胃癌、80 例癌前病變及50 例慢性非萎縮性胃炎患者分別作為胃癌組、癌前病變組和胃炎組。胃癌組男性42 例，女性38例；年齡24～75 歲，中位年齡56 歲，平均（59.84±13.50）歲。癌前病變組男性55 例，女性25 例；年齡18～82 歲，中位年齡55 歲，平均（57.46±13.78）歲。胃炎組男性31 例，女性19 例，年齡18～72 歲，中位年齡54 歲，平均（55.44±12.63）歲。癌前病變組經(jīng)病理診斷，35 例患者為慢性萎縮性胃炎伴腸型化生，24 例患者為慢性萎縮性胃炎伴輕度異型增生，15 例患者為慢性萎縮性胃炎伴中度異型增生，6 例患者為慢性萎縮性胃炎伴重度異型增生。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)影像學(xué)、內(nèi)鏡病理學(xué)檢查確診為胃癌、癌前病變或者慢性非萎縮性胃炎；②胃癌前病變患者為慢性萎縮性胃炎伴有腸上皮化生、異型增生；③既往未接受過任何抗癌治療；④簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有胃癌家族遺傳病史；②有嚴(yán)重心臟病病史或肝、腎功能不全；③合并其他惡性腫瘤。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。3 組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 主要試劑和儀器

兔抗人整合素β1 單克隆抗體（ab52971，美國Abcam 公司），鼠抗人Kindlin-2 單克隆抗體（MAB2617，美國Millipore 公司）。免疫組織化學(xué)試劑盒（PV-9000，北京中山金橋生物科技有限公司），DAB 辣根過氧化物酶顯色試劑（P0202，上海碧云天生物科技有限公司）。全自動型石蠟切片機(jī)（德國SLEE 公司），BX60 光學(xué)倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司），TK-C1381 圖像采集系統(tǒng)（日本JVC 公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法

取石蠟塊連續(xù)切片，烘烤后常規(guī)滴加二甲苯脫蠟，并用梯度酒精溶液浸泡；滴加檸檬酸枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行組織抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，滴加3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。滴加整合素β1 單克隆抗體或Kindlin-2 單克隆抗體，以PBS緩沖液作為陰性對照，4℃孵育過夜。滴加二抗，DAB染色5～7 min，用自來水沖洗后終止染色反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，加入鹽酸水溶液分化，水洗后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果判斷

由麗水市人民醫(yī)院病理科2 位主治醫(yī)生進(jìn)行雙盲法閱片。整合素β1 著色部位主要是細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)，Kindlin-2 著色部位主要是細(xì)胞質(zhì)。根據(jù)染色強度，從無、淡黃色、棕黃色及深褐色分別記為0、1、2 和3 分。另外根據(jù)陽性細(xì)胞百分比，從0%、≤10%、＞10%～50%、＞50%～75%及＞75%染色細(xì)胞分別記為0、1、2、3 和4 分。染色指數(shù)=染色強度×陽性細(xì)胞數(shù)，若染色指數(shù)≥2 則視為陽性表達(dá)，否則為陰性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗或χ2趨勢檢驗，進(jìn)一步的兩兩比較用χ2分割法；兩變量相關(guān)分析用Spearman 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組臨床資料比較

3 組年齡、性別及不同發(fā)病部位等臨床資料比較，經(jīng)方差分析或χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3 組臨床資料比較

2.2 3 組整合素β1 和Kindlin-2 蛋白表達(dá)比較

3 組整合素β1 和Kindlin-2 蛋白陽性表達(dá)比較，經(jīng)χ2趨勢檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。3 組整合素β1 和Kindlin-2 蛋白陽性表達(dá)率逐漸升高，經(jīng)χ2分割法檢驗，癌前病變組與胃癌組整合素β1和Kindlin-2 蛋白陽性表達(dá)率高于胃炎組（χ2=6.598和34.667，P=0.010 和0.000），且胃癌組整合素β1和Kindlin-2 蛋白陽性表達(dá)率亦高于癌前病變組（χ2=18.576，P=0.000）。見表2和圖1。

表2 3 組整合素β1 和Kindlin-2 蛋白陽性表達(dá)率比較例（%）

圖1 3 組整合素β1 和Kindlin-2 蛋白表達(dá)情況 （免疫組織化學(xué)染色）

2.3 3 組整合素β1 與Kindlin-2 蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman 秩相關(guān)性檢驗，胃炎組與癌前病變組整合素β1 與Kindlin-2 蛋白表達(dá)無相關(guān)性（P＞0.05）；而胃癌組整合素β1 與Kindlin-2 蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

2.4 癌前病變組Kindlin-2 蛋白和整合素β1 表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

癌前病變組不同年齡、性別、發(fā)病部位及病理類型患者的整合素β1 和Kindlin-2 蛋白陽性表達(dá)情況比較，經(jīng)χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

2.5 胃癌組Kindlin-2 蛋白和整合素β1 表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

胃癌組不同浸潤深度、臨床病理分期、腫瘤直徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的整合素β1 陽性表達(dá)率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。胃癌組不同腫瘤浸潤深度、臨床病理分期、腫瘤直徑及血管侵襲患者的Kindlin-2 蛋白陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表3 3 組整合素β1 與Kindlin-2 蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 例

表4 癌前病變組臨床病理因素與整合素β1 和Kindlin-2 蛋白表達(dá)的關(guān)系 例（%）

表5 胃癌組臨床病理因素與Kindlin-2 蛋白和整合素β1 表達(dá)的關(guān)系 例（%）

續(xù)表5

3 討論

在我國，早期胃癌的確診率較低，一方面與胃癌發(fā)病隱匿、早期癥狀不典型有關(guān)[5]；另一方面也與我國胃癌篩查普及不理想有關(guān)[6]。從發(fā)病機(jī)制角度出發(fā)，篩選、發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物對提高早期胃癌的診斷率和臨床個體化治療具有重要的臨床價值。

整合素是細(xì)胞表面重要的黏附分子，通過α、β非共價鍵連接形成異二聚體跨膜糖蛋白，主要介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間、細(xì)胞-胞外基質(zhì)間的黏附作用，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、分化及遷移等生物學(xué)過程。不同腫瘤細(xì)胞表面整合素受體類型也存在一定的差異[7]，例如在胃癌組織中，整合素α3β1 表達(dá)明顯增加[8]。由于整合素受體亞型眾多，因此本實驗選取整合素β1 作為研究重點。在正常生理狀態(tài)下，整合素β1 需要在活化蛋白的輔助下激活后與胞外基質(zhì)配體結(jié)合形成黏附結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步募集α-Catenin、Talin 等黏附分子并連接細(xì)胞骨架，可介導(dǎo)雙向信號通路激活，以維持細(xì)胞增殖-凋亡平衡。DONG 等[9]學(xué)者證實，整合素α3 β1 通過介導(dǎo)ERK1/2 信號通路激活，從而維持腫瘤干細(xì)胞表型，促進(jìn)胃癌的發(fā)生。整合素屬于T、B 淋巴細(xì)胞表面表達(dá)的胃腸道炎癥關(guān)鍵介質(zhì)，可促使免疫細(xì)胞被選擇性招募到炎癥部位，參與胃腸道黏膜的炎癥反應(yīng)。張青松等[10]學(xué)者通過在Mass ARRAY 平臺上篩選，發(fā)現(xiàn)整合素存在6 個基因多態(tài)性位點，其中ITGA1rs2447867 與非賁門癌的發(fā)生風(fēng)險密切相關(guān)。在我國，消化道潰瘍、慢性胃炎都屬于非賁門癌的重要危險因素，因此整合素介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在非賁門癌的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。既往多數(shù)研究只是證實，整合素在胃癌早期轉(zhuǎn)移以及化療耐藥中發(fā)揮著重要作用[11-13]，但在本研究中通過免疫組織化學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)整合素β1 在胃癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于胃炎和癌前病變組織，推斷整合素也可能與胃癌癌變的發(fā)生有一定的關(guān)系。

另外，Kindlin 黏著斑白蛋白屬于整合素活化蛋白，通過與整合素β 亞基胞內(nèi)尾段結(jié)合增加整合素與胞外基質(zhì)的親和力，進(jìn)而激活下游一系列信號通路和轉(zhuǎn)錄因子等，參與細(xì)胞癌變的發(fā)生[14]。ZHAO 等[15]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Kindlin-2 蛋白表達(dá)后，可促使乳腺癌細(xì)胞進(jìn)入G2/M 期，從而增加其增殖活性；而且在乳腺浸潤性微乳頭狀癌（invasive micropapillary carcinoma,IMPC）組織中Kindlin-2 表達(dá)量與整合素β1 具有一定的正相關(guān)性，兩者均與IMPC 極性倒轉(zhuǎn)、集團(tuán)性侵襲和高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。本研究中也發(fā)現(xiàn)整合素β1 和Kindlin-2 在癌前病變和胃癌組織中的表達(dá)顯著高于胃炎組織，說明在胃癌早期就可以檢測到兩者表達(dá)異常，并且隨著胃癌惡性化程度的加重，Kindlin-2 蛋白和整合素β1 的表達(dá)都隨之增加。但是筆者分析上述兩者與癌前病變患者臨床病理因素的關(guān)系時，并未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性；而且在胃炎患者和胃癌癌前病變患者中，Kindlin-2 蛋白陽性表達(dá)和整合素β1 的陽性表達(dá)并未表現(xiàn)出正相關(guān)性。但是在胃癌患者中，兩者陽性表達(dá)呈顯著的正相關(guān)：一方面可能是由于納入的樣本量偏少；另一方面推測Kindlin-2蛋白和整合素β1 是參與胃癌癌前病變向胃癌進(jìn)展的重要分子，兩者在胃癌的發(fā)生過程中發(fā)揮協(xié)同作用，在進(jìn)入胃癌發(fā)展階段后，Kindlin-2 可激活整合素β1，并增加整合素β1 對細(xì)胞外基質(zhì)、可溶性蛋白等配體的親和力，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等。

綜上所述，整合素β1 和Kindlin-2 蛋白在胃炎、癌前病變和胃癌組織中的表達(dá)逐漸升高，推測可能與胃癌的發(fā)生存在一定的相關(guān)性。而且隨著胃癌患者惡性化程度的加重，整合素β1 和Kindlin-2 蛋白陽性表達(dá)率也逐漸升高，與腫瘤浸潤深度、臨床病理分期及腫瘤直徑等臨床病理因素有關(guān)。近年來分子靶向治療是胃癌研究的熱點，本研究證實整合素β1 和Kindlin-2 蛋白有望成為胃癌早期診斷和個體化治療的潛在靶點，并且為肺癌發(fā)病機(jī)制的研究、靶向藥物的研發(fā)提供了新的思路。