和曉春，邱 娟，常 蕾，劉偉芬，李祿輝

(1 河南能源焦煤中央醫(yī)院西藥房，焦作 454000；2 河南能源焦煤中央醫(yī)院病理科，焦作 454000；3 河南應用技術職業(yè)學院制藥工程學院，鄭州 450042)

帕金森病(parkinson’s disease，PD)是一種老年人常見的神經(jīng)退行性疾病，認知功能障礙是其臨床主要特征，該疾病嚴重影響患者生活質(zhì)量[1]。PD發(fā)病機制復雜，線粒體功能障礙、氧化應激、神經(jīng)炎性反應、凋亡等均與其發(fā)病相關[2]。研究其具體的發(fā)病機制，有針對性的治療對延緩PD進展具有重要意義。目前主要是通過藥物延緩PD的發(fā)展，開發(fā)保護神經(jīng)的新藥有利于提高PD患者的生活質(zhì)量，也是今后PD藥物治療的研究方向[3]?？ㄍ衅绽?captopril，Cap)是一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，常用于治療高血壓。研究報道，卡托普利可不同程度的改善血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)對PC12細胞的抑制作用，并減緩細胞衰老[4]?？ㄍ衅绽谂两鹕游锬Ｐ椭锌杀Ｗo黑紋狀體多巴胺神經(jīng)元免受損傷[5]。Cap還可增強抗氧化應激能力，減輕肝細胞脂肪變性及炎癥反應，對非酒精性脂肪肝有一定的防治作用[6]。然而，Cap對帕金森模型細胞凋亡和氧化應激的影響及其機制尚不清楚。研究表明，lncRNA在精神相關疾病中起重要作用[7]。心肌肥大相關因子(cardiac hypertrophy related factors，CHRF)上調(diào)表達加重了白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)誘導的ATDC5細胞炎癥性損傷[8]。CHRF體內(nèi)敲除可明顯預防缺血性損傷，并減輕神經(jīng)功能障礙[9]。說明CHRF可調(diào)控細胞的炎癥反應，且與神經(jīng)功能障礙有關。本實驗通過用1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpy ridinium ion，MPP+)誘導SK-N-SH細胞建立PD細胞模型，研究Cap對帕金森模型細胞凋亡和氧化應激的影響及其機制是否與CHRF有關。

1 材料與方法

1.1 材料

SK-N-SH細胞購自武漢普賽諾生命科技有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Sigma公司；青霉素-鏈霉素雙抗購自上海素爾生物科技有限公司；1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-Methyl-4-phenylpy ridinium ion，MPP+)購自北京謹明生物科技有限公司；卡托普利注射液(生產(chǎn)廠家：常州制藥廠有限公司，生產(chǎn)批號：國藥準字H10970294，規(guī)格：1 ml∶25 mg)；丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒、谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠(Annexin V-FITC/PI)試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自碧云天生物技術研究所；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；FACSCanto Ⅱ流式細胞儀購自美國 Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

SK-N-SH細胞用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每周換液3次，待細胞融合至90%左右時，進行消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 細胞處理與分組

用100 μmol/L的MPP+處理SK-N-SH細胞建立帕金森病模型，記為MPP+組；用濃度分別為0.5、5、50 μg/ml的Cap處理SK-N-SH細胞24 h后再用100 μmol/L的MPP+處理，作為Cap低、中、高濃度組(MPP++Cap-L組、MPP++Cap-M組、MPP++Cap-H組)；未經(jīng)任何處理的細胞作為對照組(Con)；同時以50 μmol/L司來吉蘭(SEL)和100 μM的MPP+處理作為陽性對照藥組(MPP++SEL)。將si-NC、si-CHRF轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細胞中再用100 μmol/L的MPP+處理，記為MPP++si-NC組、MPP++si-CHRF組。將si-CHRF、pcDNA、pcDNA-CHRF轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細胞后用50 μg/ml Cap和100 μmol/L MPP+處理，記為MPP++Cap+si-CHRF組、MPP++Cap+pcDNA組、MPP++Cap+pcDNA-CHRF組。

1.4 丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量檢測

細胞培養(yǎng)48 h后收集各組細胞及細胞培養(yǎng)上清液，用MDA試劑盒、GSH試劑盒分別檢測MDA、GSH含量，按試劑盒說明書進行操作。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

細胞培養(yǎng)48 h后用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，與500 μl的結合緩沖液混勻。先加入 10 μl Annexin V-FITC，再加入5 μl碘化丙錠(PI)，混勻后避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.6 蛋白質(zhì)印跡(western blot)法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達

細胞培養(yǎng)48 h后提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，再分別加入一抗(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2000)室溫孵育90 min，TBST洗滌；用ECL發(fā)光液顯影，用ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像，用Quantity One凝膠分析軟件測定各組蛋白條帶的灰度值，蛋白相對表達水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。每個蛋白樣品設3個重復。

1.7 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)法檢測CHRF表達水平

各組細胞培養(yǎng)48 h，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，按照熒光定量試劑盒說明進行PCR，每個樣品設3個重復，循環(huán)條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；60 ℃延長 5 min。相對表達量用2-△△Ct法計算。CHRF以GAPDH為內(nèi)參，CHRF上游引物序列：5’-GTGTTAGCCACCACTACCCAGC-3’，下游引物序列：5’--CCACAGCCCACAACTTTCAAG-3’；GAPDH上游引物序列：5’-CCCCATACACAGTGTTAGCC-3’，下游引物序列：5’-GAGTGATTTTCCCGTCC-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Cap對MPP+誘導SK-N-SH細胞氧化應激的影響

與對照組相比，MPP+組SK-N-SH細胞中MDA含量升高，GSH含量降低(P<0.05)；與MPP+組相比，卡托普利低、中、高濃度組及陽性對照藥物組SK-N-SH細胞中MDA含量降低，GSH含量升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 卡托普利對MPP+誘導SK-N-SH細胞氧化應激的影響

2.2 Cap對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡的影響

與對照組相比，MPP+組SK-N-SH細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高(P<0.05)；與MPP+組相比，卡托普利低、中、高濃度組及陽性對照藥物組SK-N-SH細胞凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，且呈濃度依賴性(P<0.05)。見圖1和表2。

A：凋亡相關蛋白的表達；B：細胞凋亡流式圖圖1 卡托普利對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡的影響

表2 卡托普利對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡的影響

2.3 Cap對MPP+誘導SK-N-SH細胞中l(wèi)ncRNA CHRF表達的影響

與對照組相比，MPP+組CHRF表達水平升高(P<0.05)；與MPP+組相比，Cap低、中、高濃度組及陽性對照藥物組CHRF表達水平降低，且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表3。

表3 卡托普利對MPP+誘導SK-N-SH細胞中l(wèi)ncRNA CHRF表達的影響

2.4 抑制lncRNA CHRF表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷的影響

與MPP++si-NC組相比，MPP++si-CHRF組CHRF表達水平降低，凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，MDA含量降低，GSH含量升高(P<0.05)；與MPP++si-CHRF組相比，MPP++Cap+si-CHRF組CHRF表達水平降低，凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，MDA含量降低，GSH含量升高(P<0.05)。見圖2和表4。

A:凋亡相關蛋白的表達；B:細胞凋亡流式圖圖2 抑制lncRNA CHRF表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡的影響

表4 抑制lncRNA CHRF表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷的影響

2.5 lncRNA CHRF過表達逆轉(zhuǎn)了Cap(50 μg/ml)對MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷的作用

與MPP+組相比，MPP++Cap組CHRF表達水平降低，細胞凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，MDA含量降低，GSH含量升高(P<0.05)；與MPP++Cap+pcDNA組相比，MPP++Cap+pcDNA-CHRF組CHRF表達水平升高，細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高，MDA含量升高，GSH含量降低(P<0.05)。見圖3和表5。

表5 lncRNA CHRF過表達逆轉(zhuǎn)了卡托普利對MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷的作用

A:凋亡相關蛋白的表達；B:細胞凋亡流式圖圖3 lncRNA CHRF過表達逆轉(zhuǎn)了卡托普利對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡的作用

3 討論

帕金森病是常發(fā)于老年人的一種慢性進行性疾病，隨著人口的老齡化，其發(fā)病率逐漸升高[10]。氧化應激造成的氧化性損傷可促進多巴胺能神經(jīng)元凋亡，因此氧化應激在PD發(fā)展中起重要作用，抗氧化應激在一定程度上可治療PD[11]。本實驗結果顯示，MPP+誘導的SK-N-SH細胞中丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量升高，谷胱甘肽(Glutathione，GSH)含量降低，且細胞凋亡率升高。表明MPP+可誘導SK-N-SH細胞氧化應激的產(chǎn)生以及促進細胞凋亡。

研究報道，Cap可下調(diào)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平和MMP-9的表達，并減輕腦水腫和改善神經(jīng)功能[12]。Cap通過抑制自噬和激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedprotein kinase，AMPK)可減弱病毒肽PrP介導的神經(jīng)元凋亡[13]。Cap對局灶性腦缺血具有神經(jīng)保護作用[14]。Cap通過腦組織氧化損傷改善了脂多糖誘導的大鼠學習和記憶障礙[15]。Cap對人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化損傷具有保護作用，可提高其活力，增強超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，降低MDA含量,呈現(xiàn)一定的濃度依賴性[16]。本實驗結果顯示，Cap處理后，MPP+誘導的SK-N-SH細胞中MDA含量降低，GSH含量升高，細胞凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低。表明Cap可抑制氧化應激的產(chǎn)生以及抑制細胞凋亡，Cap對MPP+誘導的SK-N-SH細胞損傷具有保護作用。

研究表明，lncRNA可參與調(diào)控細胞凋亡和氧化應激水平，如沉默CHRF可增加脂多糖誘導的H9c2細胞活性、抑制細胞凋亡、抑制ROS的產(chǎn)生和炎性因子的表達，可保護H9c2細胞免受脂多糖誘導的損傷[17]。纈沙坦通過下調(diào)CHRF減輕心力衰竭過程中的心臟功能障礙和損傷[18]。以上結果表明CHRF與細胞凋亡，氧化水平及炎癥反應均相關。本實驗結果顯示，MPP+誘導SK-N-SH細胞中CHRF表達水平升高；抑制CHRF表達，抑制了MPP+誘導的SK-N-SH細胞凋亡和氧化應激。Cap處理后，CHRF表達水平降低；卡托普利處理的同時抑制CHRF表達，更顯著地抑制了MPP+誘導的SK-N-SH細胞凋亡和氧化應激；且CHRF過表達逆轉(zhuǎn)了Cap對MPP+誘導的SK-N-SH細胞損傷的保護作用。

綜上所述，Cap通過下調(diào)CHRF表達，可抑制MPP+誘導的SK-N-SH細胞損傷。