許晶冰，李雪，賀稚非，毛慶

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶，401121)3(重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，重慶，401329) 4(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

骨頭約占動物體重的20%～30%，是一種營養(yǎng)價值非常高的肉類加工副產(chǎn)物，含有大量的礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等營養(yǎng)成分[1]。科學(xué)界對骨的研究利用逐漸深入，對骨進(jìn)行100%加工利用，制備骨粉、骨泥、骨蛋白、軟骨素、骨油、骨碳等，既可變廢為寶，又能減少環(huán)境的污染[2-9]。兔肉由于“四高”、“四低”的營養(yǎng)特性，被視為功能性肉制品而風(fēng)靡全球[10]。兔肉產(chǎn)量的增加，兔骨等兔肉加工副產(chǎn)品也隨之增多，大多數(shù)企業(yè)直接將兔骨拋棄或當(dāng)作飼料，兔骨的附加值低且對環(huán)境造成負(fù)擔(dān)。目前，兔骨的加工利用研究尚處于起步階段，如何對兔骨進(jìn)行高效加工和在其余食品原料中的應(yīng)用等仍需進(jìn)一步研究。

項目組[11-15]前期利用干法球磨技術(shù)，制備得到平均粒徑為0.5～21.9 μm的微細(xì)兔骨粉，并研究了其部分營養(yǎng)及理化性質(zhì)，這為兔骨粉作為優(yōu)質(zhì)鈣源奠定了基礎(chǔ)，但制備的骨粉脂肪含量較高(8%～13%)，這會使骨粉產(chǎn)生腥味等不良風(fēng)味，且不利于骨粉的長期保存，若將兔骨粉更好地應(yīng)用于其他食品中，仍需要進(jìn)一步脫脂。因此，本研究選取適當(dāng)部位兔骨為原料，采用項目組前期研究的高溫高壓蒸煮預(yù)處理制備兔骨粉，然后利用Box-Behnken響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲波輔助法對兔骨脫脂，制備得到無異味的脫脂兔骨粉(de-fat rabbit bone meal, DF-RBM)，這將為骨粉在食品中的應(yīng)用提供適宜的原料，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用兔購于重慶市渝北區(qū)阿興記原種兔養(yǎng)殖基地，品種為伊拉配套系商品代，日齡70～75 d(體重2.5 kg左右)，按常規(guī)方法宰殺、去皮、去頭、去內(nèi)臟后，取兔的四肢，用手術(shù)刀及手術(shù)剪小心剔除四肢骨表面肌肉、脂肪、骨連接處結(jié)締組織等，保留骨的部分，真空密封包裝后于-21 ℃凍藏備用。

正己烷、乙酸乙酯為優(yōu)級純，濃硫酸為分析純，成都科龍化工試劑廠；石油醚(30～60 ℃，分析純)，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DZ-400真空包裝機(jī)，沈陽東泰機(jī)械制造有限公司；LDZM-80KCS 壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；FW100 高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；BJ-800A 粉碎機(jī)，杭州拜杰科技有限公司；KQ-600DB 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HWS-26 恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；Basis Hei-VAP Value 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，德國海道夫公司；DHG-9053 J 恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；B-81 脂肪抽提測定儀，瑞士步琪公司；KJELTEC 8400 全自動凱氏定氮儀，丹麥福斯公司；Milli-q reference 超純水系統(tǒng)，美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 兔骨粉的制備

根據(jù)李少博等[12,14]納米級兔骨粉的制備工藝并作少量修改，對兔骨進(jìn)行高溫蒸煮軟化處理，工藝流程如下：

凍骨4 ℃解凍→清水漂洗3次→高溫高壓蒸煮[液料比1.5∶1(g∶g)，0.12 MPa、120 ℃，蒸煮2 h]→冷卻至100 ℃→傾倒蒸煮液取出骨→清水漂洗3次→瀝干→折斷成2～3 cm碎骨→50 ℃烘干過夜→粉碎機(jī)初步粉碎。

清水漂洗的目的是去除骨表面多余脂肪、血水及水溶性蛋白質(zhì)等。干燥后的碎骨，用BJ-800A粉碎機(jī)(粉碎6 s、停頓6 s)粉碎數(shù)次，粉碎至過60目篩(250 μm)后，得到兔骨粉(rabbit bone meal, RBM)。

1.3.2 脫脂劑的選擇

設(shè)計60 ℃熱水組、乙酸乙酯組、正己烷組3組實驗，篩選出適宜兔骨粉的脂肪提取劑。取5 g RBM至50 mL離心管中，按照液料比3∶1(g∶g)分別加入3種脫脂劑，恒溫(熱水組設(shè)定溫度60 ℃，其余組室溫30 ℃)150 r/min搖床混搖2 h，再將骨粉置于提前預(yù)熱好的超聲機(jī)中，固定超聲波處理溫度(熱水組設(shè)定溫度60 ℃，其余組30 ℃，超聲波過程用冰袋控制溫度)、超聲波功率300 W、超聲波處理時間30 min，超聲結(jié)束后在4 000 r/min下離心10 min，離心結(jié)束后立即傾倒上清液，取剩余骨渣于60 ℃干燥至恒重，分別制備得到RBM1、RBM2、RBM3。

按國標(biāo)法[16-18]測定RBM及RBM1、RBM2、RBM3的蛋白質(zhì)含量、水分含量、脂肪含量，按公式(1)和(2)計算脫脂率及蛋白質(zhì)保留率，比較不同溶劑的脫脂效果：

(1)

(2)

式中：R，脫脂率，%；W，蛋白質(zhì)保留率，%；w0，RBM脂肪含量(干基)，%；w1，脫脂后骨粉脂肪含量(干基)，%；w0蛋白質(zhì)，RBM蛋白質(zhì)含量(干基)，%；w1蛋白質(zhì)，脫脂后骨粉蛋白質(zhì)含量(干基)，%。

1.3.3 單因素試驗

在室溫(30 ℃)條件下，對RBM進(jìn)行超聲波輔助脫脂工藝優(yōu)化單因素試驗，各因素基本條件：超聲波功率300 W、超聲波處理時間30 min、液料比3∶1(g∶g)。

脫脂工藝：取5 g RBM至50 mL離心管中，按液料比加入脫脂劑，斡旋振動1 min，然后置于提前預(yù)熱好的超聲波清洗機(jī)(30 ℃)中處理，超聲波處理過程用冰袋控制溫度；之后于4 000 r/min下離心10 min，離心結(jié)束后立即傾倒上清液，溶劑用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收(蒸發(fā)溫度44 ℃)，取剩余骨渣于60 ℃下干燥至恒重。各單因素試驗參數(shù)如下：

單因素1(液料比)試驗：液料比2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1(g∶g)；

單因素2(超聲波功率)試驗：超聲波功率240、300、360、420、480 W；

單因素3(超聲波處理時間)試驗：超聲波處理時間0、5、10、15、20、25、30、40 min。

以上共計18組樣品，測定所有樣品脂肪及水分含量，按公式(1)計算脫脂率(%)。

1.3.4 超聲波處理輔助脫脂工藝響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，篩選出液料比5∶1(g∶g)、超聲波功率360 W、超聲波處理時間15 min為最優(yōu)，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，以脫脂率(%)為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，試驗設(shè)計如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗各因素水平設(shè)計表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3.5 超聲波輔助法脫脂工藝驗證

響應(yīng)面試驗結(jié)束后，根據(jù)模型預(yù)測液料比5.33∶1(g∶g)，超聲波功率460 W，超聲波處理時間24.44 min為脫脂最優(yōu)工藝參數(shù)，此時脫脂率預(yù)測達(dá)到97.31%。因此，根據(jù)生產(chǎn)實際，進(jìn)行驗證實驗。

取5 g RBM至50 mL離心管中，按液料比5.3∶1(g∶g)加入脫脂劑乙酸乙酯，斡旋振動1 min，然后將樣品置于提前預(yù)熱好的超聲波清洗機(jī)(30 ℃)中，超聲波功率480 W，超聲波處理時間24 min，超聲波過程中用冰袋控制溫度。之后于4 000 r/min下離心10 min，離心結(jié)束后立即傾倒上清液，溶劑回收，取剩余骨渣于60 ℃下干燥至恒重，測定樣品脂肪及水分含量，按公式(1)計算脫脂率(%)。根據(jù)實驗結(jié)果，計算驗證值與預(yù)測值的相對誤差，判斷模型有效性。最后確定超聲波輔助法兔骨脫脂工藝的最優(yōu)參數(shù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂劑的選擇

參考劉文媛等[19]及秦曉潔等[20]在制備脫脂牛骨中的研究，選擇了幾種提取效果好、安全性高的試劑進(jìn)行脫脂實驗，結(jié)合生產(chǎn)實際，選取60 ℃熱水、乙酸乙酯、正己烷對兔骨粗粉進(jìn)行脫脂，分別制備得到RBM1、RBM2、RBM3。各提取劑的脫脂效果如圖1所示,與熱水相比，乙酸乙酯和正己烷的脫脂效果較好。在脫脂率方面，熱水的脫脂率僅19.57%，顯著低于乙酸乙酯(68.08%)、正己烷(64.65%)(P<0.05)；而在保留蛋白質(zhì)方面，熱水提取脂肪后兔骨粉蛋白質(zhì)流失較大，這可能與骨中的水溶性蛋白流失及加熱條件下膠原蛋白等降解有關(guān)[21]，蛋白質(zhì)保留率為63.91%，顯著低于其余2組(P<0.05)，其中，乙酸乙酯對骨粉中的蛋白質(zhì)保留率高達(dá)99.74%，對骨粉中的蛋白質(zhì)含量基本沒影響，而正己烷組的蛋白質(zhì)保留率為89.80%，這可能是由于部分蛋白極性較小與正己烷相容后流失。綜上，基于較高的脫脂率、蛋白質(zhì)保留率，篩選出乙酸乙酯作為兔骨粉的脫脂劑。

圖1 不同提取劑制備的兔骨粉脫脂效果Fig.1 Degreasing effect of rabbit bone meal prepared with different extraction reagents注：同一指標(biāo)下不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.2 單因素試驗

在室溫條件下，以乙酸乙酯為脫脂劑，采用超聲波輔助工藝對RBM進(jìn)行脫脂，用單因素試驗探究液料比、超聲波功率及超聲波處理時間對脫脂率的影響，試驗結(jié)果如圖2所示。由圖2-a可知，液料比2∶1～5∶1(g∶g)時，隨著液料比的增加，RBM的脫脂率顯著增加(P<0.05)，當(dāng)液料比達(dá)到5∶1(g∶g)時，脫脂率高達(dá)88.86%，液料比繼續(xù)提高至6∶1(g∶g)時，脫脂率不再顯著升高(P>0.05)，這與秦曉潔等[20]在牦牛骨脫脂中的研究結(jié)果一致，當(dāng)脫脂溶劑用量增大到一定程度后，動物骨中油脂已大部分溶出，再增加溶劑用量也無法提高濃度差導(dǎo)致的傳質(zhì)推動力[22]；由圖2-b可知，隨著超聲波功率的增大，超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械振動增強(qiáng)，促進(jìn)了分子擴(kuò)散[23]，因而RBM脫脂率提高，當(dāng)超聲波功率提高至360 W時，脫脂率高達(dá)89.38%，而超聲波功率繼續(xù)提高后，脫脂率卻顯著降低(P<0.05)，這與劉文媛等[19]的研究結(jié)果一致，可能是過高的超聲波動使溶液中產(chǎn)生自由基及局部的瞬時高溫對油脂產(chǎn)生破壞作用所致，因而超聲波功率不宜過大；而超聲波處理時間對RBM脫脂率的影響類似，如圖2-c所示，當(dāng)超聲波處理時間超過25 min后，脫脂率顯著降低(P<0.05)，且在提取過程中發(fā)現(xiàn)長時間的超聲波提取，會導(dǎo)致溶劑呈白色懸濁液，這可能是由于長時間的超聲波動導(dǎo)致了溶液的乳化，從而降低了提取效率，因而超聲波處理時間不宜過長，且從生產(chǎn)成本考慮，超聲波處理15 min即可達(dá)到較好的脫脂率(79.73%)，這與超聲波處理20～25 min差異不大。綜上，選取液料比5∶1(g∶g)，超聲波功率360 W，超聲波處理時間15 min，作為后續(xù)優(yōu)化實驗的最適條件。

圖2 各因素對RBM脫脂率的影響Fig.2 The influence of various factors on the degreasing rate of RBM

2.3 響應(yīng)面試驗

響應(yīng)面試驗共17個試驗點(diǎn)，其中5個零點(diǎn)試驗以評估誤差，12個為析因點(diǎn)，試驗結(jié)果如表2所示。將表2中的數(shù)據(jù)運(yùn)用Design-Expert 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，得到脫脂率(R)與液料比(A)、超聲波功率(B)、超聲波時間(C)之間的二次回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

R=88.16+1.30A+2.64B+0.92C+0.56AB+0.53AC+0.03BC-0.24A2-0.04B2+0.56C2，R2=0.927 3

對回歸方程的ANOVA方差分析結(jié)果如表3所示，模型的F值為9.91，P<0.01，說明脫脂率R與液料比(A)、超聲波功率(B)、超聲波處理時間(C)回歸方程的關(guān)系極顯著，方程可用；失擬項平方和較小(1.22)，P>0.05，表示不具顯著性差異，說明方程與實際擬合度高，其他因素對試驗結(jié)果的干擾較?。恍旁氡容^高，為10.85(>4)，表明該模型可用于預(yù)測，方程的可信度高；變異系數(shù)小，僅為1.07%(<15%)，表明試驗重現(xiàn)性好，模型可靠[24-25]。綜上所述，以脫脂率為響應(yīng)值所建立的兔骨粉超聲波輔助脫脂優(yōu)化工藝的模型是合理的，該模型可對兔骨粉超聲波輔助脫脂工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化并對脫脂率進(jìn)行預(yù)測。由表3中各項系數(shù)的顯著性檢驗可知，該模型的一次項A和B極顯著(P<0.01)，對模型貢獻(xiàn)大，C的P值<0.05，對脫脂率影響顯著；交互作用項AB、AC、BC及平方項A2、B2、C2均不顯著(P>0.05)。

表3 脫脂率回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model on degreasing rate

響應(yīng)面3D圖可以較為直觀地顯示出響應(yīng)值隨因素的變化情況，曲面越陡峭表明該因素對響應(yīng)值的影響越大，而投影下的等高線圖越近似橢圓形，表示這2個因素對響應(yīng)值的交互作用就越強(qiáng)[12]。根據(jù)F值及響應(yīng)面3D圖可以判斷，液料比、超聲波功率及超聲波處理時間對兔骨的脫脂率都有一定的影響，且影響程度為超聲波功率B>液料比A>超聲波時間C，而2因素之間的交互性不顯著，這與秦曉潔等[20]的研究結(jié)果一致。

2.4 驗證實驗

經(jīng)過 Design-Expert 10.0軟件統(tǒng)計分析，設(shè)置在脫脂率大于85%的情況下，預(yù)測出超聲波輔助脫脂的最優(yōu)工藝為液料比5.33∶1(g∶g)，超聲波功率460 W，超聲波處理時間24.44 min，脫脂率預(yù)測值為97.31%。結(jié)合生產(chǎn)實際的可操作性，將上述工藝進(jìn)行微小改動，調(diào)整為液料比5.3∶1(g∶g)，超聲波功率480 W，超聲波處理時間24 min。在此條件下進(jìn)行5次重復(fù)試驗，得到兔骨粉RBM的脫脂率為(94.63±0.20)%，這與理論預(yù)測值的相對誤差為2.75%(<5%)，故模型有效。因此，經(jīng)單因素試驗、響應(yīng)面法優(yōu)化得到的兔骨粉超聲波輔助法脫脂工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，這將為生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

圖3 各因素交互作用對RBM脫脂率影響的3D圖Fig.3 3D diagram of the interaction of various factors on the degreasing rate of RBM

3 結(jié)論

本試驗在室溫(30 ℃)條件下，利用超聲波輔助溶劑對兔骨粉進(jìn)行脫脂工藝優(yōu)化，篩選出乙酸乙酯為兔骨粉脫脂劑，該脫脂劑脫脂效果好，且對骨粉中的蛋白質(zhì)保留率高；經(jīng)單因素試驗，超聲輔助脫脂的最佳工藝條件為液料比5∶1(g∶g)、超聲波功率360 W、超聲波處理時間15 min；根據(jù)單因素及Box-Behnken響應(yīng)面試驗，建立了兔骨粉脫脂工藝的數(shù)學(xué)模型，得到兔骨超聲波輔助脫脂工藝最優(yōu)參數(shù)為液料比5.3∶1(g∶g)，超聲波功率480 W，超聲波處理時間24 min，此條件下制備得到無異味的DF-RBM，脫脂率達(dá)到(94.63±0.20)%，與理論預(yù)測值的相對誤差<5%，故模型能較好地預(yù)測脫脂工藝參數(shù)對兔骨粉的脫脂效果，這將對改善兔骨等動物骨粉的加工提供參考。