鄭開福 劉宇健 唐希陽(yáng) 姜濤 李小飛 趙晉波

氣管是連接肺和外界大氣的唯一通道，對(duì)維持生命具有至關(guān)重要的作用。目前手術(shù)切除重建是治療長(zhǎng)段氣管損傷、腫瘤、狹窄等疾病最主要的方式之一。然而由于氣管的活動(dòng)度較小，切除的長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)會(huì)因吻合口張力過(guò)大導(dǎo)致手術(shù)失敗，目前臨床上氣管切除的長(zhǎng)度極限為6 cm或不超過(guò)兒童氣管的1/3[1-2]。因此對(duì)于長(zhǎng)段氣管的切除重建是臨床上一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的難題，其中組織工程氣管是目前氣管替代物研究中的熱點(diǎn)。隨著3D打印技術(shù)的發(fā)展，將3D打印技術(shù)與組織工程技術(shù)相結(jié)合成為一個(gè)新的研究方向，通過(guò)打造與原生氣管生物性能更加接近的組織工程氣管[3]，可能為臨床治療長(zhǎng)段氣管缺損提供更好的方式。在3D打印技術(shù)應(yīng)用于氣管重建的研究中，最常用的一種應(yīng)用是采用3D打印技術(shù)構(gòu)建氣管支架，通過(guò)支架來(lái)進(jìn)行組織工程的再生；此外，另外一種應(yīng)用是采用3D打印技術(shù)將種子細(xì)胞等進(jìn)行植入和三維立體培養(yǎng)，此類應(yīng)用涉及到生物3D打印的范疇，在本文中暫時(shí)不做討論。

一、3D打印氣管支架的材料與設(shè)計(jì)

氣管由于其解剖位置的特殊性，要求3D打印氣管支架不僅要具備足夠的強(qiáng)度以維持通氣功能，同時(shí)還需要有一定的活動(dòng)性，能夠抵抗一定的彎曲和旋轉(zhuǎn)所帶來(lái)的應(yīng)力。材料和支架結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)是影響支架性能的重要因素。

目前用于3D打印的材料主要包括天然聚合物和合成聚合物[4]。與合成聚合物相比，天然聚合物擁有更好的生物相容性，更有利于人工氣管周圍組織的長(zhǎng)入，促進(jìn)氣管再血管化、氣管軟骨及纖毛上皮的再生，但是天然聚合物的力學(xué)性能較低，限制了其在氣管支架中的應(yīng)用。合成聚合物具有更好的穩(wěn)定性以及更高的強(qiáng)度，因此氣管支架的制造多采用合成聚合物，包括聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）、聚氨酯（polyurethane，PU）、聚乳酸（polylactic acid，PLL A）、聚乳酸羥基乙酸（poly lactoglycolic acid，PLGA）等[5]。PCL由于其優(yōu)異的生化特性，如熔點(diǎn)低、無(wú)毒、可降解、生物相容性好、較強(qiáng)的抗拉伸性[6]，使PCL成為氣管支架研究中應(yīng)用最廣泛的材料。但PCL材料是否是最適合用于氣管支架的制造并沒(méi)有明確的答案。Ahn等[7]采用PU和PCL設(shè)計(jì)了相同的支架結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示PU材料制造的氣管比PCL的機(jī)械性能更好。目前關(guān)于不同材料的氣管支架的對(duì)比研究較少，同時(shí)材料學(xué)的迅速發(fā)展，各種新型材料也層出不窮，何種材料最適合于氣管替代物的制造還需要進(jìn)一步研究。

圓筒狀氣管與波紋狀氣管是目前氣管支架主要的兩種結(jié)構(gòu)形態(tài)。Park等[8]研究表明在三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)中，雖然圓筒狀氣管能夠提供更強(qiáng)的力學(xué)強(qiáng)度，但是通過(guò)分析整體的壓力分布發(fā)現(xiàn)圓筒狀氣管的壓力集中在受壓點(diǎn)，形變程度明顯，管腔直徑明顯降低，而波紋狀氣管可以將壓力均勻分布于整個(gè)氣管，受力均勻，形變程度明顯低于波紋狀氣管，管腔直徑基本沒(méi)有改變。Park等[9]將波紋狀氣管與原生氣管相比，波紋狀氣管可承受的三點(diǎn)彎曲的強(qiáng)度為（1.088±0.161）MPa，原生氣管為（0.214±0.125）MPa，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ahn等[7]的研究中增加了3D打印氣管支架在扭轉(zhuǎn)維度的力學(xué)測(cè)試，結(jié)果也表明波紋狀氣管更加的靈活，具有更大的扭轉(zhuǎn)角度。由此可見(jiàn)波紋狀氣管是相對(duì)較好的一種用于氣管重建的設(shè)計(jì)方式（表1）。波紋狀氣管是對(duì)原生氣管的一種仿生設(shè)計(jì)，因此在設(shè)計(jì)氣管結(jié)構(gòu)時(shí)，應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物原生氣管的軟管環(huán)與軟骨環(huán)的間隔以及軟骨環(huán)的寬度，進(jìn)而以實(shí)際數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)波紋與波紋的間隔以及波紋的寬度，達(dá)到仿生效果。

多孔結(jié)構(gòu)是3D打印組織器官研究的一個(gè)熱點(diǎn)，目的是為促進(jìn)移植物周圍的細(xì)胞長(zhǎng)入移植物。研究[10]表明孔隙直徑為300 μm最適于氣管組織長(zhǎng)入，同時(shí)為加快氣管移植物的軟骨、上皮、血管等再生，通常在氣管支架上種植上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等。但是研究[11]表明接種的細(xì)胞劑量與氣管移植物發(fā)生狹窄密切相關(guān)，隨著種植細(xì)胞劑量的提高，氣管移植物的功能可隨之得到改善。Best等[11]設(shè)計(jì)了多孔和無(wú)孔的C型環(huán)氣管支架并進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示在相同培養(yǎng)條件下，無(wú)孔氣管支架的細(xì)胞增殖的密度高于多孔氣管支架，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與傳統(tǒng)的觀念有較大的差異。因此進(jìn)一步探究3D打印氣管支架的空隙直徑，平衡細(xì)胞種植劑量與氣管組織的長(zhǎng)入是后續(xù)研究的重要內(nèi)容。另一方面，氣管支架的厚度、降解速率等因素對(duì)促進(jìn)細(xì)胞黏附、血管及氣管軟骨再生均具有重要的影響，但是目前關(guān)于這方面的研究很少，還需要進(jìn)一步探索。

二、3D打印氣管支架的組織再生問(wèn)題

理想的氣管替代物除在結(jié)構(gòu)上能維持呼吸道的通暢，保證基本的通氣功能外，在功能上還應(yīng)該盡可能達(dá)到與原生氣管一致的水平，因此在長(zhǎng)段氣管缺損的修復(fù)重建中氣管替代物的再上皮化、再血管化及新生軟骨形成是需要解決的3個(gè)重要問(wèn)題。單純的3D打印氣管支架促進(jìn)新生的上皮、血管及軟骨形成的能力較弱，同時(shí)也可引起較嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肉芽組織的生成，造成氣管移植物的狹窄。為解決這些問(wèn)題，不同研究團(tuán)隊(duì)探索不同的方法（表2），包括種植上皮細(xì)胞、耳廓軟骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等促進(jìn)組織再生，將支架包被凝膠、細(xì)胞外基質(zhì)為組織再生提供內(nèi)環(huán)境等[20]。

1. 3D打印氣管支架的再上皮化

氣管腔內(nèi)完整假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮是抗感染的重要因素[21]，假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮缺損可引起持續(xù)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肉芽組織的形成，造成氣道狹窄。Chan等[15]以新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，使用單純的PCL氣管進(jìn)行移植，隨訪4周發(fā)現(xiàn)氣管替代物發(fā)生嚴(yán)重狹窄，狹窄程度為83%～98%，肉芽組織增生明顯，僅在吻合口附近有少量纖毛上皮再生，移植物中央未見(jiàn)新生上皮組織。Bhora等[12]采用牛真皮細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）作為支架內(nèi)襯構(gòu)建人工氣管，將其移植到豬的氣管中，結(jié)果與Chan團(tuán)隊(duì)相似。劉春全等[14]將PCL氣管支架復(fù)合軟骨細(xì)胞進(jìn)行移植，發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞基本覆蓋整個(gè)管腔需要6個(gè)月，而纖毛上皮的生成需要更長(zhǎng)的時(shí)間。因此單純依靠吻合口兩端原生氣管的上皮細(xì)胞爬行到氣管移植物管腔表面難度較高，長(zhǎng)段氣管替代物的再上皮化還需依賴于在氣管替代物上種植上皮細(xì)胞。Park等[13]首先將含有脫細(xì)胞的氣管黏膜外基質(zhì)的水凝膠覆蓋在氣管內(nèi)表面，然后將人下鼻甲間充質(zhì)干細(xì)胞片覆蓋在水凝膠上構(gòu)建組織工程氣管。將該人工氣管移植到兔氣管中，結(jié)果顯示2個(gè)月時(shí)兔的氣管管腔光滑，新生的成熟上皮完全覆蓋整個(gè)管腔表面，僅在吻合口處可見(jiàn)輕微的狹窄。該方法成功的使氣管腔內(nèi)的上皮再生，基本恢復(fù)正常氣道內(nèi)皮的一個(gè)正常功能，但還需要更長(zhǎng)期的隨訪觀察及大型動(dòng)物研究進(jìn)一步驗(yàn)證該方式的可靠性。

表1 不同材料及結(jié)構(gòu)氣管支架力學(xué)性能

表2 3D打印氣管支架對(duì)修復(fù)長(zhǎng)段氣管缺損的研究結(jié)果

2. 3D打印氣管支架的再血管化

血管是氣管替代物營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)的基本來(lái)源，新生血管的生成能夠?yàn)樯掀ず蛙浌翘峁I(yíng)養(yǎng)，進(jìn)一步促進(jìn)纖毛柱狀上皮和軟骨組織的生成。在氣管替代物移植前進(jìn)行預(yù)血管化是使用最多的方法。大網(wǎng)膜具有豐富的血運(yùn)，Park等[9]將PCL氣管在兔子的大網(wǎng)膜中包埋2周后取出移植，組織學(xué)檢查結(jié)果顯示氣管支架內(nèi)有大量的新生血管形成，同時(shí)氣管管腔內(nèi)可見(jiàn)纖毛柱狀上皮和黏膜下層，新生組織中未見(jiàn)明顯炎癥。而在未預(yù)血管化組織出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，新生組織沒(méi)有明顯的結(jié)構(gòu)層次。Gao等[1]將氣管包埋在裸鼠背部皮下，取得了類似的結(jié)果。然而不管是包埋在大網(wǎng)膜還是皮下，均須取出后再進(jìn)行移植。Gao等[16]將包被有軟骨細(xì)胞水凝膠的PCL氣管包埋在頸旁肌肉中2周，然后在原位進(jìn)行氣管移植。優(yōu)點(diǎn)在于在預(yù)血管化之后不用離斷氣管替代物與周圍組織已經(jīng)形成的血管，可以為氣管替代物提供長(zhǎng)期的血供。在該研究中經(jīng)過(guò)預(yù)血管化的氣管替代物軟骨細(xì)胞和纖毛上皮再生情況明顯優(yōu)于未預(yù)血管化的氣管替代物。因此，預(yù)血管化是促進(jìn)氣管替代物血管再生的一種可行方法。

3. 3D打印氣管支架的軟骨形成

氣管軟骨是為氣道提供力學(xué)支撐的重要結(jié)構(gòu)，防止由于呼吸運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致氣管塌陷而發(fā)生呼吸阻塞。長(zhǎng)段氣管缺損的目標(biāo)是3D打印的氣管支架隨著時(shí)間逐步降解，同時(shí)C型軟骨逐步形成，最終由氣管軟骨為氣管替代物提供力學(xué)支撐。

Park等[8]將肝素化的明膠海綿環(huán)與波紋狀氣管復(fù)合，在明膠海綿環(huán)上負(fù)載可以緩釋的TGF-β1，同時(shí)種植人鼻中隔來(lái)源的軟骨細(xì)胞，將該組織工程氣管埋置在裸鼠背部皮下8周，結(jié)果顯示明膠海綿中充滿軟骨樣組織，阿爾新藍(lán)和番紅染色顯示新生組織中含有豐富的糖胺聚糖，這進(jìn)一步表明軟骨的形成。由于明膠海綿為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此新生的軟骨有望形成與原生氣管一樣的C型軟骨。葛陽(yáng)等[17]采用軟骨細(xì)胞膜片與3D打印聚酰胺支架復(fù)合，包埋在裸鼠皮下8周可見(jiàn)大量軟骨陷窩形成，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)。張恒一等[18]采用種植耳廓軟骨細(xì)胞的明膠（gelatin，GT）/PCL靜電紡納米纖維膜與聚乳酸己內(nèi)酯（poly DL-lactideε-caprolactone，PLCL）支架復(fù)合構(gòu)建組織工程氣管，發(fā)現(xiàn)C型環(huán)狀軟骨結(jié)構(gòu)形成。然而，Xia等[19]將PCL復(fù)合軟骨細(xì)胞的氣管支架在山羊中進(jìn)行移植，但是僅在吻合口處可見(jiàn)軟骨樣組織形成，這與皮下包埋的結(jié)果差距較大。因此，在氣管原位移植中軟骨的再生還需進(jìn)一步研究。

4. 抗感染及抗炎作用

由于移植早期氣管腔內(nèi)的纖毛上皮還未形成，氣管替代物無(wú)法順利將異物及氣道分泌物排出。Xia等[19]的研究表明導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡最主要的原因是由于肉芽組織增生導(dǎo)致氣管狹窄。因此制造具有抗感染和炎癥反應(yīng)的支架對(duì)減輕肉芽組織生成、避免管腔狹窄具有十分重要的意義。Lee等[22]在3D打印PCL氣管與普朗尼克F127非對(duì)稱多孔膜復(fù)合，該膜的空隙為納米級(jí)，能有效防止纖維結(jié)締組織侵入氣管腔，并能滲透黏膜再生所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。研究[22]表明非對(duì)稱多孔膜能夠明顯減輕氣管腔的肉芽組織生成。另一方面，Kang等[23]的研究表明在氣管支架表面采用離子液體聯(lián)合氧化石墨烯修飾可以提高支架的抗感染能力。因此，后續(xù)的研究應(yīng)該進(jìn)一步探索氣管的表面結(jié)構(gòu)改性，使人工氣管具有更好的組織相容性和更長(zhǎng)的生存時(shí)間。

5. 總結(jié)

綜上所述，3D打印氣管支架用于長(zhǎng)段氣管缺損的修復(fù)是可行的。首先，氣管支架的強(qiáng)度明顯優(yōu)于原生氣管，PCL等可降解吸收材料的降解速度較慢，足以維持移植早期氣管腔內(nèi)的通暢。其次，通過(guò)仿生設(shè)計(jì)，支架在三點(diǎn)彎曲、徑向壓縮及扭轉(zhuǎn)試驗(yàn)中都獲得了較為滿意的力學(xué)性能，基本達(dá)到原生氣管的力學(xué)要求。最后，3D打印氣管支架為上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等黏附提供了基本骨架作用，另一方面將強(qiáng)度較大的支架與強(qiáng)度較低的細(xì)胞外基質(zhì)、水凝膠等復(fù)合，在皮下、大網(wǎng)膜、頸旁肌肉等位置進(jìn)行包埋預(yù)血管化，進(jìn)一步促進(jìn)3D打印氣管支架的再上皮化、血管化及軟骨再生。但是3D打印氣管支架還存在一些問(wèn)題。首先，氣管支架對(duì)于機(jī)體屬于異物，這可能是導(dǎo)致許多動(dòng)物氣管腔內(nèi)肉芽組織增生的重要原因之一。其次，大部分研究的支架設(shè)計(jì)沒(méi)有考慮到原生氣管后膜的作用，使移植后氣管排除異物及抗感染能力下降，影響長(zhǎng)期的生存質(zhì)量。最后，與上皮再生相比，軟骨再生的周期較長(zhǎng)，對(duì)于支架的降解速度是基于材料在體外的降解速度判斷的，在體內(nèi)支架的降解速度與軟骨形成速度是否能夠匹配還有待進(jìn)一步的觀察研究。

三、展望

理想的氣管替代物應(yīng)該具有適當(dāng)?shù)臋C(jī)械性能、充足的血供、完整的氣管內(nèi)皮組織、C型結(jié)構(gòu)的軟骨環(huán)[24]，最終形成與原生氣管一致的氣管，即纖毛柱狀上皮為內(nèi)襯，C型環(huán)狀軟骨做支撐的結(jié)構(gòu)。因此，同時(shí)種植兩種或兩種以上細(xì)胞促進(jìn)氣管替代物朝原生氣管方向分化可能是未來(lái)的一個(gè)重要方向。Kim團(tuán)隊(duì)[25-26]進(jìn)行了嘗試，使用新西蘭兔的鼻內(nèi)側(cè)黏膜上皮細(xì)胞和耳廓軟骨細(xì)胞分別與藻酸鹽水凝膠在體外均勻混合，聯(lián)合PCL材料，采用3D打印技術(shù)打印出5層結(jié)構(gòu)的人工氣管，最內(nèi)層和最外層為含孔隙結(jié)構(gòu)的PCL支架，中間為無(wú)空隙結(jié)構(gòu)的PCL支架，兩層支架之間內(nèi)層為含上皮細(xì)胞的水凝膠，外層為含軟骨細(xì)胞的水凝膠。但是該研究為氣管部分缺損的修復(fù)（10 mm×10 mm），是否適用于長(zhǎng)段氣管缺損的修復(fù)還有待進(jìn)一步研究。另一方面，隨著各種新型材料的發(fā)現(xiàn)，還應(yīng)該進(jìn)一步對(duì)不同材料的3D打印氣管進(jìn)行對(duì)比研究，選取最佳的材料。同時(shí)氣管的微觀結(jié)構(gòu)，包括空隙的直徑、厚度、形狀、表面修飾等均是影響細(xì)胞黏附的重要因素，需要進(jìn)一步研究并在活體實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。