張志強 王曉舟 馬 怡 鄭 爽 韓彧佳 赫麗杰

乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，是1個由多基因變異、表觀遺傳改變、多個蛋白結(jié)構(gòu)或功能異化相作用而導(dǎo)致的疾病[1]。MiRNA是一類小分子非編碼RNA，家族眾多，功能各異，有研究報道，let-7a可抑制肺癌細胞的活性[2]，miR-373可促進乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移[3]，而miR-98能抑制乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移[4]。我們擬通過收集乳腺癌患者和健康人對照的臨床標(biāo)本，檢測miR-98和let-7b的表達，并檢測其對乳腺癌細胞的增殖的影響，以期為乳腺癌的發(fā)病和進展的病理機制提供新的視野。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

收集2018年1月至12月期間在遼寧省人民醫(yī)院就診的乳腺癌患者，收集其乳腺癌組織和癌旁組織，健康人乳腺組織標(biāo)本來自于乳腺癌病理檢查陰性的健康人。乳腺癌患者58例，平均年齡為(46.7±19.3)歲，健康人對照67例，平均年齡(39.8±20.5)歲。

1.2 試劑與細胞

SKBR3細胞購自于ATCC(美國)，DMEM 1640培養(yǎng)基購自Gibco(美國)，BSA購自Thermo(美國)，MTT購自Sigma(美國)，miR-98和let-7b的mimic和inhibitor均購自Thermo(美國)，RT-PCR所用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR-GREEN試劑盒均購自TOYOBO(日本)。

1.3 RT-PCR法檢測miRNA在臨床標(biāo)本中的表達

將收集的乳腺組織標(biāo)本剪碎，加入液氮研磨，制成單細胞懸液。用TRIzol法抽提總RNA，紫外分光光度法進行定量，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，根據(jù)SYBR Green試劑盒進行RT-PCR實驗，用2-ΔΔct法分析數(shù)據(jù)。引物設(shè)計為miR-98，Pr：5'-GGGGTGAGGTAGTAAGTTGT-3'，Pf：5'-TGGGTGTCGTGGAGTC-3'；let-7b，5'-UUG GUG UGU UGG AUG AUG GAG U-3'[5]，GAPDH，Pr：5'-TGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3' Pf：5'-TGGAAGGTGGACAGCGAGGC-3'，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 MTT檢測miR-98和let-7b對細胞系增殖的影響

在6孔板中培養(yǎng)SKBR3細胞，至狀態(tài)良好、密度約60%時加入miR-98和let-7b mimic或inhibitor，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間，每孔加入5 mg/l的MTT溶液20 μl，培養(yǎng)4 h后吸盡培養(yǎng)液，加入PBS洗3次，吸盡余液，加入150 μl DMSO，在37 ℃恒溫搖床上溫和震蕩10 min，上酶聯(lián)免疫檢測儀，570 nm波長處讀取OD值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用Graphpad prism 6對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組之間均數(shù)的比較用t檢驗，多組均數(shù)之間的比較用方差分析。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，文中圖表上以*表示P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 miR-98和let-7b在乳腺癌標(biāo)本中表達下調(diào)

將收集的臨床標(biāo)本分為3組，分別為健康人對照(n=67)，癌旁組織(n=57)和癌組織(n=57)，RT-PCR檢測收集的臨床標(biāo)本中miR-98和let-7b的表達水平，結(jié)果顯示，乳腺癌癌組織中miR-98和let-7b的表達水平顯著低于癌旁組織和健康人對照，見圖1A和圖1B。

圖1 RT-PCR檢測標(biāo)本中miR-98(A)和let-7b(B)的表達

2.2 miR-98和let-7b抑制乳腺癌細胞系增殖

培養(yǎng)SKBR3細胞，分別加入miR-98和let-7b的 mimic或inhibitor，在24 h、36 h、48 h、60 h和72 h后MTT檢測細胞增殖的水平。結(jié)果顯示，在加入miR-98或let-7b的mimic 72 h后，細胞增殖水平顯著降低，而在加入miR-98或let-7b的inhibitor 72 h后細胞增殖水平顯著增高。這表明，miR-98和let-7b均能抑制SKBR3細胞增殖，見圖2。

圖2 MTT檢測miR-98(A)和 let-7b(B)對SKBR3細胞增殖的影響

3 討論

乳腺癌確切病因和發(fā)病機制尚未明確，有研究報道，BRCA、PTEN、TP53等基因突變會導(dǎo)致乳腺癌發(fā)病風(fēng)險增加[6]，基因甲基化等表觀遺傳改變會增加患乳腺癌的幾率[7]，miRNA[8]、EGFR[9]突變等可參與乳腺癌細胞的增殖和遷移。導(dǎo)致乳腺癌發(fā)病的因素眾多，而促進乳腺癌細胞增殖和遷移的因素則是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)病和進展的關(guān)鍵因素。

miRNA在腫瘤的增殖和遷移中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，有研究報道，miR-98可抑制結(jié)腸癌細胞攝取糖分和糖酵解作用，并抑制其增殖[10]。miR-98通過下調(diào)TALL4的表達來抑制小細胞肺癌的進展[11]，血清miR-98處于低水平被認為是小細胞肺癌不良預(yù)后的指標(biāo)[12]。miR-98可抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[13]，這與我們的研究基本一致。還有研究報道，miR-98可抑制B細胞產(chǎn)生IL-10來抑制腫瘤[14]，而IL-10是免疫負向調(diào)節(jié)因子，這表明miR-98還可參與抗腫瘤的免疫調(diào)節(jié)。

let-7b在大多數(shù)腫瘤中都表達下調(diào)[15]，并抑制腫瘤[14]。研究報道，let-7b可通過調(diào)節(jié)IN1來抑制胃癌的惡性進展[16]，let-7b可通過調(diào)節(jié)組蛋白的泛素化來抑制細胞的遷移[17]。let-7b可抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[18]，與我們的研究基本相符。let-7b可調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化，并促進腫瘤相關(guān)的巨噬細胞的遷移能力[19]，表明let-7b也可參與抗腫瘤的免疫調(diào)節(jié)。

綜上所述，我們的研究表明，在乳腺癌中，miR-98和let-7b的表達下調(diào)，二者可抑制乳腺癌細胞的增殖。這表明，miR-98和let-7b有作為乳腺癌治療靶點的潛力。我們下一步將研究miR-98和 let-7b抑制增殖的靶蛋白和具體的分子生物學(xué)機制，并在動物模型上進一步驗證我們的研究結(jié)論。