柳燕杰 田旭平 李倩

摘要：為了提高基因的表達(dá)效率，利用葉綠體基因工程提高美國(guó)紅梣的重要特性，利用Codon W 1.4.2和在線軟件CUSP分析了美國(guó)紅梣葉綠體基因組中的52條基因編碼序列密碼子偏好性。結(jié)果表明，美國(guó)紅梣葉綠體基因組密碼子的GC含量依次為GC1（45.23%）>GC2（39.23%）>GC3（26.19%）;有效密碼子數(shù)（ENC）范圍為37.55～55.28，其中ENC值>45的有34個(gè);RSCU>1的密碼子有29個(gè)，其中14個(gè)以U結(jié)尾、12個(gè)以A結(jié)尾，表明其偏好以A、U結(jié)尾，且偏倚很弱。中性點(diǎn)圖分析表明，GC12與GC3的相關(guān)系數(shù)為0.321 7，回歸系數(shù)為-0.538 5，相關(guān)性不顯著;美國(guó)紅梣葉綠體基因組的GC含量是高度保守的，密碼子偏好主要受環(huán)境選擇的影響;17個(gè)密碼子被確定最優(yōu)密碼子。本研究為美國(guó)紅梣葉綠體遺傳工程和遺傳多樣性分析提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：美國(guó)紅梣;葉綠體基因組;密碼子偏好性;選擇

中圖分類號(hào)： S718.43 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）15-0083-06

美國(guó)紅梣（Fraxinus pennsylvanica）是木犀科（Oleaceae）梣屬（Fraxinus）喬木，原產(chǎn)美國(guó)，雌雄異株，花先葉開放，喜光、抗寒、抗鹽堿、抗水濕，是我國(guó)重要的行道樹或庭園綠化樹種[1]。

在生物體傳遞遺傳信息的過程中，作為聯(lián)結(jié)核酸和蛋白質(zhì)的密碼子扮演著重要的角色[2]，密碼子被稱為第二套遺傳密碼[3];密碼子使用的選擇方式不僅影響基因的表達(dá)[4]，也影響基因相應(yīng)的功能[5]。構(gòu)成基因組的4種核苷酸可形成64種密碼子，各密碼子與氨基酸相對(duì)應(yīng)，除甲硫氨酸和色氨酸外，其余18種氨基酸均有2～6個(gè)密碼子，這些編碼同一氨基酸的不同密碼子被稱為同義密碼子（synonymous codon）[6];在翻譯過程中，每個(gè)氨基酸相對(duì)應(yīng)同義密碼子的使用頻率存在差異，即有的同義密碼子使用頻率高于其他同義密碼子，這種現(xiàn)象被稱為密碼子偏好性（codon usage bias）[7]。密碼子偏好性廣泛存在于不同生物中，是因?yàn)槲锓N在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中受環(huán)境選擇、堿基突變、基因漂變等因素共同作用，還受到基因組大小、tRNA豐度和基因表達(dá)水平等的影響[8]。密碼子偏好性通過對(duì)基因翻譯準(zhǔn)確性和效率的調(diào)節(jié)影響基因的表達(dá)水平[9]，葉綠體具有基因組小、基因拷貝數(shù)多等特點(diǎn)[10-11];根據(jù)最優(yōu)密碼子設(shè)計(jì)葉綠體基因表達(dá)載體，可迅速提高葉綠體基因組中基因表達(dá)量，利用目前已知的密碼子使用模式推斷未知基因的表達(dá)，或預(yù)測(cè)某些未知基因的功能[12];同時(shí)親緣關(guān)系較近的物種具有相近的密碼子使用模式[13]，因此，研究葉綠體基因組密碼子的使用模式，對(duì)于探索物種進(jìn)化、提高外源基因的表達(dá)水平具有重要意義。

與核基因組對(duì)比，關(guān)于葉綠體基因組的密碼子偏性的研究相對(duì)滯后，美國(guó)紅梣的葉綠體基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成，但有關(guān)密碼子偏性的研究迄今尚無報(bào)道。研究美國(guó)紅梣葉綠體密碼子的偏性，對(duì)于預(yù)測(cè)基因的表達(dá)水平、確定未知基因的位置和改良外源基因有著重要意義。在本研究中，筆者通過對(duì)美國(guó)紅梣葉綠體基因組編碼DNA序列（CDS）的堿基組成和中性繪圖分析，推斷了影響美國(guó)紅梣葉綠體密碼子偏好性的主要因素，并確定了美國(guó)紅梣葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子。本研究通過分析美國(guó)紅梣葉綠體基因組密碼子使用模式及影響密碼子使用偏好的因素，確定美國(guó)紅梣葉綠體基因組的密碼子偏好性和最優(yōu)密碼子，為美國(guó)紅梣葉綠體基因組的應(yīng)用和研究提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

美國(guó)紅梣（Fraxinus pennsylvanica）葉綠體基因組序列來自NCBI數(shù)據(jù)庫，共下載到82條CDS（coding DNA sequence），剔除7條重復(fù)基因序列和23條長(zhǎng)度小于300 bp的序列[14]，其余52條序列用于本研究的分析。

1.2 方法

在葉綠體通用密碼子表中有64個(gè)密碼子，TAA、TGA和TAG是終止密碼子，不編碼任何氨基酸。ATG是蛋氨酸的唯一密碼子，TGG是色氨酸的唯一密碼子，這些密碼子沒有偏性，在分析時(shí)被剔除。

1.2.1 密碼子組成分析 將50條符合條件的CDS整合為1個(gè).fasta文件中，應(yīng)用Codon W 1.4.2軟件分析獲得各CDS的有效密碼子數(shù)（effective number of codon，ENC）和同義密碼子相對(duì)使用度（RSCU），并應(yīng)用在線軟件CUSP（http：//emboss.toulouse.inra.fr/cgi-bin/emboss/cusp）分析測(cè)定密碼子第1、第2、第3位堿基的GC含量（分別為GC1、GC2、GC3）和3位堿基的GC平均含量（GCall）等參數(shù)，結(jié)果用SPSS和Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。有效密碼子數(shù)（ENC）是衡量同義密碼子使用偏好的重要指標(biāo)，ENC的取值范圍為20～61，ENC值可以反映密碼子偏倚的強(qiáng)弱，當(dāng)ENC為20時(shí)，同義密碼子完全處于偏倚狀態(tài);當(dāng)ENC值為61時(shí)，同義密碼子沒有偏倚;ENC值從小到大表示偏倚性由強(qiáng)變?nèi)?，通常可以ENC值45作為區(qū)分偏倚性強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)[15]。RSCU是一個(gè)密碼子的實(shí)際使用頻率與無使用偏性時(shí)理論頻率的比率，無偏倚時(shí)，RSCU為1;RSCU小于1則代表該密碼子的實(shí)際使用頻率低于其他同義密碼子的使用頻率，反之實(shí)際頻率高于其他同義密碼子的使用頻率[16]。用SPSS軟件對(duì)不同密碼子位置的GC1、GC2、GC3、GCall進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析密碼子數(shù)（N）與ENC的相關(guān)關(guān)系，進(jìn)而判斷各因素對(duì)密碼子偏倚的影響。

1.2.2 中性繪圖分析 簡(jiǎn)并密碼子第3堿基通常發(fā)生的為同義突變，而簡(jiǎn)并密碼子第1位、第2位上突變通常會(huì)改變基因的功能或活性;也就是說，當(dāng)沒有外壓時(shí)，密碼子3個(gè)位置的堿基組成應(yīng)該沒有差別;而在存在一定選擇壓力情況下時(shí)，密碼子3個(gè)位置上的堿基組成是存在差異的[17]。在以GC1和GC2的平均值GC12和GC3分別作為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)的中性繪圖中，每個(gè)散點(diǎn)代表一個(gè)基因。如果中性圖中的所有基因都沿對(duì)角線分布，即GC12和GC3的變異基本相同，則密碼子3個(gè)位置的堿基組成無顯著差異，選擇壓力弱，但受突變影響較大;回歸系數(shù)（對(duì)角線斜率）是衡量中性程度的指標(biāo)之一，若回歸曲線斜率極小，GC12和GC3的變異的相關(guān)性同樣很低，說明影響密碼子偏好性的主要影響因素為選擇效應(yīng)[17]。同時(shí)，通過分析不同位置密碼子堿基組成的相關(guān)性，可以分析突變或選擇對(duì)密碼子偏好性的影響，即當(dāng)GC12與GC3顯著相關(guān)時(shí)，表明3個(gè)位置密碼子堿基組成無顯著差異，且偏好性主要受突變的影響;當(dāng)GC12與GC3呈不顯著相關(guān)時(shí)，回歸系數(shù)趨近于0，表明密碼子的前2位堿基和第3位堿基的組成不同，基因組中的GC含量比較保守，密碼子的偏倚主要受到選擇的影響[13]。

1.2.3 最優(yōu)密碼子的確定 以美國(guó)紅梣每個(gè)葉綠體基因的ENC為參考標(biāo)準(zhǔn)，從兩端選擇10%的基因構(gòu)建高、低偏倚庫，將2庫間ΔRSCU≥0.08的密碼子定義為高表達(dá)的優(yōu)越密碼子;將RSCU值大于1的密碼子確定為高頻密碼子[18]。將既能滿足高頻率密碼子又能滿足高表達(dá)優(yōu)越密碼子確定為最優(yōu)密碼子。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子堿基組成

用CUSP軟件分析美國(guó)紅梣52條CDS的堿基組成，用Codon W 1.4.2分析其ENC值（表1），所有CDS密碼子的平均GC含量為36.93%，第1位GC含量為45.23%，第2位為39.23%，第3位為26.19%，GC含量在密碼子不同位置的分布頻率不同，由高到低，依次為第1位>第2位>第3位，第1、第2位的GC含量明顯高于第3位，結(jié)果表明，在美國(guó)紅梣中，葉綠體密碼子的最后1個(gè)堿基主要是A/U（T），這與植物葉綠體基因中A/U（T）含量較高的特點(diǎn)是一致的。表示偏好強(qiáng)度的ENC值的范圍為37.55～55.28，平均值為47.27;52個(gè)CDS中有34個(gè)ENC值>45，說明美國(guó)紅梣的大部分編碼序列具有弱的密碼子偏好性。對(duì)不同密碼子位置堿基的GC含量、密碼子數(shù)（N）和ENC數(shù)值的相關(guān)分析（表2）表明，GCall和GC1、GC2、GC3的相關(guān)性極顯著，GC1和GC2相關(guān)性極顯著，相關(guān)系數(shù)為0.513，GC3與GC1、GC2的相關(guān)性不顯著，說明密碼子的第1位和第2位堿基的組成與第3位堿基組成的相似和不同。ENC與GC1顯著相關(guān)，與GC2相關(guān)性不顯著，與GC3極顯著相關(guān)，說明ENC與密碼子第3位堿基的組成密切相關(guān)。ENC與密碼子數(shù)（N）顯著相關(guān)，說明基因編碼序列的長(zhǎng)度對(duì)密碼子的偏倚有一定的影響。

編碼氨基酸的RSCU（表3）顯示，RSCU>1的密碼子中以A和U結(jié)尾的頻率較高，其中14個(gè)密碼子以U結(jié)尾、12個(gè)以A結(jié)尾、1個(gè)以G結(jié)尾，表明美國(guó)紅梣葉綠體基因組更傾向于以A和U結(jié)尾;而以C和G結(jié)尾的密碼子即為非偏性的密碼子。

2.2 中性繪圖分析

根據(jù)美國(guó)紅梣葉綠體基因組中每個(gè)基因的中性繪圖分析（圖1），GC12的取值范圍略大在0.314～0.529之間，GC3的取值范圍很小，為0.193～0.392之間，同時(shí)大多數(shù)基因均位于對(duì)角線以上;GC12與GC3的相關(guān)系數(shù)為0.321 7，相關(guān)性不顯著，回歸系數(shù)（趨勢(shì)線的斜率）為-0.538 5，表明在美國(guó)紅梣葉綠體基因組的中性繪圖分析中，GC12和GC3的相關(guān)性很弱，說明密碼子第1位、第2位和第3位堿基的組成存在差異，即美國(guó)紅梣葉綠體基因組的GC含量是高度保守的，而密碼子第3位的GC含量相對(duì)較低，其密碼子偏好性受選擇的影響較大。

2.3 最優(yōu)密碼子確定

將美國(guó)紅梣葉綠體基因組中的52個(gè)蛋白編碼基因并作一個(gè)整體在Codon W 1.4.2軟件上運(yùn)行，通過構(gòu)建高表達(dá)基因和低表達(dá)基因庫，對(duì)這2個(gè)基因數(shù)據(jù)庫的RSCU值進(jìn)行了重新計(jì)算，結(jié)果（表4）表明，ΔRSCU≥0.08的密碼子包括UUU（TTT）、UUA（TTA）等23個(gè)密碼子，都是高表達(dá)的優(yōu)越密碼子，其中11個(gè)以A結(jié)尾，8個(gè)以U結(jié)尾，3個(gè)以C結(jié)尾，1個(gè)為G結(jié)尾;ΔRSCU≥0.3有11個(gè)密碼子;ΔRSCU≥0.5 的密碼子是UUU、 UUA。 以同時(shí)滿足高頻率密碼子和高表達(dá)優(yōu)越密碼子作為最優(yōu)密碼子，分別為UUU、UUA、GUA、UCA、CCA、UAU、GCA、CAU、CAA、AAU、AAA、GAA、UGU、CGA、AGA、GGU和GGA等17個(gè)，其中11個(gè)以A結(jié)尾，6個(gè)以U結(jié)尾。

3 討論與結(jié)論

在生物體內(nèi)，密碼子在核酸和蛋白質(zhì)的翻譯中起著重要作用;植物中不同密碼子的使用頻率存在差異， 這種密碼子使用偏好性是物種和基因長(zhǎng)期進(jìn)化和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)過程中形成的，是多種因子共同作用的結(jié)果，其中突變和自然選擇是該現(xiàn)象形成的重要影響因素[7-8]。葉綠體是植物光合作用的細(xì)胞器，也包含相對(duì)獨(dú)立的母體遺傳基因組信息，因此葉綠體基因組在揭示物種進(jìn)化、物種親緣關(guān)系、物種鑒定等方面具有重要價(jià)值;同時(shí)葉綠體基因工程因其可高效表達(dá)、安全等特點(diǎn)已成為植物基因工程的研究熱點(diǎn)[10]。因此，對(duì)植物葉綠體基因組密碼子使用偏好的研究可以揭示物種基因組的進(jìn)化關(guān)系及其主要影響因素。

本研究中美國(guó)紅梣葉綠體基因組中的GC3與GC1和GC2沒有顯著相關(guān)性，且顯著小于GC1和GC2。這說明美國(guó)紅梣葉綠體基因的密碼子偏好以A和U結(jié)尾，RSCU分析結(jié)果從定量分析的角度充分證明了這一觀點(diǎn)。這與已報(bào)道的黃芩（Scutellaria baicalensis）[19]、普通油茶（Camellia oleifera）[20]、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）[15]的葉綠體基因特征相同;中性繪圖分析表明，密碼子的第1位和第2位與第3位堿基組成存在著顯著差異，由于密碼子的GC含量高度保守，密碼子的偏倚性主要受選擇的影響，與蒺藜苜蓿一致[13];美國(guó)紅梣葉綠體基因組密碼子偏好以AU結(jié)尾，且其最優(yōu)密碼子為UUU、UUA，與大多數(shù)高等植物的最優(yōu)密碼子NNA、NNU的模式一致[18]。本研究中，美國(guó)紅梣葉綠體基因組的密碼子偏好主要受到選擇的影響，同時(shí)與其他因素共同作用，確定了17個(gè)最優(yōu)密碼子，均為NNA和NNU模式。采取高表達(dá)的高頻密碼子作為最優(yōu)密碼子，在美國(guó)紅梣葉綠體基因組中選擇的17個(gè)最優(yōu)密碼子分別是UUU、UUA、GUA、UCA、CCA、UAU、GCA、CAU、CAA、AAU、AAA、GAA、UGU、CGA、AGA、GGU和GGA。美國(guó)紅梣葉綠體基因組最優(yōu)密碼子的確定，為優(yōu)化目標(biāo)基因的高效表達(dá)密碼子，從而通過葉綠體基因工程改良美國(guó)紅梣的重要性狀提供了科學(xué)依據(jù)。

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