翁健俏，賈 凡，徐 梅，梁國(guó)慶，孫 霞

(1. 杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311121； 2. 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121)

0 引言

內(nèi)耳是由耳蝸和前庭系統(tǒng)組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)人類及其他哺乳動(dòng)物的聲音和平衡感知.柯蒂氏器(Organ of Corti，OC)是耳蝸的核心聽覺元件[1].OC的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(spiral ganglion neurons, SGNs)和毛細(xì)胞(Hair cells, HCs)的不可逆轉(zhuǎn)性丟失是造成感覺神經(jīng)性耳聾的主要原因.內(nèi)耳的結(jié)構(gòu)高度特異與復(fù)雜，其發(fā)育過程受精準(zhǔn)的遺傳調(diào)控[2].已知有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子起決定作用，它們之間通過交互作用調(diào)控內(nèi)耳的發(fā)育[3-4].

GATA家族轉(zhuǎn)錄因子通過鋅指DNA結(jié)合區(qū)域與DNA上的5’-(A/T)GATA(A/G)-3’序列結(jié)合[5].6種GATA因子(GATA1-6)在不同的組織中表達(dá)，對(duì)細(xì)胞命運(yùn)決定、分化、增殖和運(yùn)動(dòng)等有重要作用[5].Gata3單倍體劑量不足(haplo-insufficiency)引起人類HDR綜合征(HDR Syndrome, Hypoparathyroidism, Sensorineural Deafness and Renal Disease).一些研究揭示了Gata3在腎臟和甲狀旁腺發(fā)育過程中所起的作用[6-7]，但Gata3如何調(diào)節(jié)聽覺系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持還不甚清楚.Gata3在早期耳板上廣泛表達(dá)，隨后限制在前感覺神經(jīng)區(qū)[8-9]，并在腹側(cè)聽囊(耳蝸原基)高表達(dá)[10].Gata3定點(diǎn)突變影響耳蝸的早期形態(tài)發(fā)育[10].Gata3在耳蝸感覺神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育和感覺神經(jīng)相關(guān)基因如Eya1、Six1和Sox2等的信號(hào)傳遞通路中必不可少[11].

從胚胎期OC與SGNs的發(fā)育、特異化開始，直到出生后結(jié)構(gòu)和功能成熟，Gata3一直在OC持續(xù)表達(dá)[12-14].出生后2、5、8 d，柯蒂氏器中Gata3的mRNA表達(dá)水平也很穩(wěn)定[13].盡管Gata3在柯蒂氏器的毛細(xì)胞中的表達(dá)隨時(shí)間有所下調(diào)[15]，但在支持細(xì)胞中仍有表達(dá)[12, 14].Gata3在出生后耳蝸的持續(xù)表達(dá)提示其極有可能在耳蝸發(fā)育后及成體階段的功能維持中起作用.

本研究推測(cè)Gata3可能通過參與成體耳蝸HCs的功能和存活過程，影響成體耳蝸的正常功能.已有研究構(gòu)建了Gata3loxp/loxp；Oto-cre條件性基因敲除系統(tǒng)(conditional knockout, CKO),用于研究Gata3對(duì)成體小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞(inner hair cells, IHCs)的功能成熟和神經(jīng)分布的影響[16].由于Otc基因在E16 ～ E18開始主要在IHCs表達(dá)，在外毛細(xì)胞(outer hair cells，OHCs)幾乎不表達(dá)，且在P3時(shí)才達(dá)到峰值，不適合對(duì)耳蝸所有類型HCs發(fā)育成熟后的結(jié)構(gòu)形成和維持的研究[16-18].本研究構(gòu)建了Gfi1-cre條件基因敲除系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了Gata3在胚胎期耳蝸以及成體耳蝸中所有類型HCs的特異性敲除.通過免疫熒光技術(shù)從細(xì)胞和分子水平研究耳蝸相關(guān)細(xì)胞和結(jié)構(gòu)的改變，探討Gata3在成體耳蝸中的調(diào)控功能和相關(guān)機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用野生型C57BL/6小鼠和特異性敲除Gata3的轉(zhuǎn)基因突變小鼠和Gfi1-cre小鼠.小鼠由甘霖實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并贈(zèng)予,飼養(yǎng)于杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)，室溫18-20 ℃.實(shí)驗(yàn)分為野生型組和突變組.Gfi1-cre小鼠和Gata3loxp/loxp小鼠交配，最終得到不同品系的突變小鼠Gata3-/-亦即Gata3-Null突變類型小鼠.本實(shí)驗(yàn)經(jīng)浙江省杭州師范大學(xué)動(dòng)物和使用中心批準(zhǔn)，并在其監(jiān)督下進(jìn)行.

1.2 小鼠基因型鑒定

小鼠胚胎時(shí)期以當(dāng)日午間見栓為 E0.5 推算；出生小鼠以出生當(dāng)天記為P0.取P10小鼠腳趾2-3 mm，50 mM NaOH裂解液法獲取PCR底物.瓊脂糖凝膠電泳及成像分析PCR 結(jié)果進(jìn)行基因型鑒定.

1.3 冰凍切片處理

小鼠胚胎的取樣：頸椎脫臼法處死母鼠，取出子宮置于4 ℃的冰PBS中，解剖出胚胎，4% PFA于4 ℃固定，置于4 ℃搖床搖1-2 h，PBS洗滌2次，每次15 min.將胚胎置于30%蔗糖脫水過夜后OCT包埋，-80 ℃保存.出生后小鼠內(nèi)耳的取樣：頸椎脫臼法處死小鼠，取出內(nèi)耳放置于4 ℃的冰PBS中，去除多余的組織，4% PFA于4 ℃固定，置于4 ℃搖床搖1-2 d，成年小鼠的內(nèi)耳需固定34 d；BS洗滌兩次，每次1 520 min，加入EDTA溶液進(jìn)行脫鈣處理，脫鈣時(shí)間7 d PBS洗滌兩次，每次1 520 min，將胚胎置于10%蔗糖溶液、15%蔗糖溶液、20%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液進(jìn)行梯度脫水后過夜，最后用OCT包埋，-80℃保存.

1.4 免疫熒光方法

取-80 ℃ OCT包埋的耳蝸組織做冰凍切片，切片厚度為 20 μm；將片子置于55 ℃烘箱2 d；2% PBST洗2次；加入 2% BSA室溫(RT)封閉 1 h；再加入用 2% BSA 稀釋的一抗，放置于4 ℃過夜；用2% PBST漂洗，共4次,加入2% BSA稀釋的二抗，用2% PBST 1×PBS 溶液靜置清洗，再用1×PBS漂洗2次；加入200 μL DAPI 在PBS(1∶5 000)中,避光5 min；再用PBS洗1次.

1.5 全耳蝸(wholemount)免疫熒光

頸椎脫臼法處死母鼠，取出子宮置于4 ℃的冰PBS中，解剖出胚胎或成體小鼠內(nèi)耳；耳蝸加入膠原酶(1 mg/mL)和中性蛋白酶(1 mg/mL)，時(shí)間根據(jù)耳蝸軟化情況定.將取出的耳蝸管置于EP管中4% PFA 4 ℃固定30 min，成年小鼠耳蝸置于EP管中4% PFA 4 ℃固定過夜；根據(jù)抗體類型選擇檸檬酸抗原修復(fù)，檸檬酸抗原修復(fù)液加熱到 95 ℃，將耳蝸管加入修復(fù)液，液體保溫修復(fù)15 min；一抗和二抗封片處理.

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)至少代表3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn).數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示.使用GraphPad Prism 8軟件，并用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P值<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 Gata3條件性敲除轉(zhuǎn)基因小鼠品系的建立

通過將Gata3基因4號(hào)外顯子兩端插入loxp序列，建立了Gata3loxp/loxp條件性基因敲除小鼠(圖1A).Gata3基因的4號(hào)外顯子編碼轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的第一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)；去除這段序列，將生成一個(gè)無功能蛋白，并造成5號(hào)外顯子閱讀框移位，形成終止密碼.本研究利用Gfi1-cre品系和Gata3loxp/loxp品系小鼠雜交，在CKO小鼠OC的毛細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)重組酶(Cre recombinase)，從而條件性地使毛細(xì)胞內(nèi)的GATA3失活(圖1B).Gfi1從E15.5開始，耳蝸只在毛細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[19].小鼠基因型分析時(shí)(圖1C)，Gata3loxp/loxp條帶大小為 303 bp，野生型條帶為 263 bp，Gfi1-cre條帶是cre條帶為416 bp，野生型無對(duì)應(yīng)cre條帶.鑒定時(shí)每只小鼠同時(shí)帶有Gata3純合條帶和一條cre條帶，結(jié)果為條件性敲除的小鼠，標(biāo)為Gata3-Null.從胚胎和成體小鼠外觀和成體小鼠活力看來，Gata3loxp/loxp純合小鼠、CKO的Gata3-Null小鼠與野生型小鼠無明顯差異.

A: Gata3loxp/loxp小鼠基因結(jié)構(gòu)圖和限制性內(nèi)切酶圖譜黃色框?yàn)镋xon 4.紅色三角為loxp序列.黑色三角為Frt序列.粗線為打靶載體(targeting vector)和Gata3基因序列的同源重組臂.綠色箭頭是基因型鑒定的引物位置. B: 獲得Gata3-Null小鼠的遺傳雜交圖. C: 小鼠基因鑒定結(jié)果.(Lan e 1) 為野生型.(Lane 2)為Gata3loxp/loxp；Gfi1-cre雜合子(Lane 3)Gata3loxp/+純合子(Lane 4)為Gata3loxp/loxp純合子.右側(cè)數(shù)字單位bp.

2.2 條件性敲除Gata3的效率分析

Gata3在小鼠內(nèi)耳的發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá).本研究利用抗Gata3免疫組化方法，觀察到Gata3在E9.5時(shí)開始在整個(gè)聽囊(otocyst)表達(dá).表達(dá)出截?cái)嗟腉ATA3蛋白質(zhì)，由于缺乏進(jìn)入細(xì)胞核的引導(dǎo)序列，從而只能停留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[20-22].本研究中使用的GATA3抗體可以識(shí)別截?cái)嗟腉ATA3. E11.5到E12.5Gata3的表達(dá)局限于聽囊的背側(cè)和中腹部.E15.5到出生后，OC發(fā)育基本成型(圖 2F)，期間可見支持細(xì)胞和毛細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)Gata3(圖 2A-E).MYO7A在毛細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，一般被用作毛細(xì)胞的Marker.在鑒定Gfi1-cre驅(qū)動(dòng)的CKOGata3-Null小鼠的敲除效率時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)從E15.5開始到P5，Gata3-Null小鼠的毛細(xì)胞核內(nèi)不再表達(dá)GATA3，而同期野生型對(duì)照的毛細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)明顯(圖 2G-2K).此期未見OC的結(jié)構(gòu)異常，但發(fā)現(xiàn)突變體與野生型對(duì)照相比較，緊鄰毛細(xì)胞下的支持細(xì)胞核內(nèi)的Gata3表達(dá)有降低現(xiàn)象.提示Gata3在毛細(xì)胞的表達(dá)水平與支持細(xì)胞的表達(dá)水平之間存在某種聯(lián)系.

A-E: Gata3在E15.5，E18.5，P0和P5期野生型小鼠毛細(xì)胞內(nèi)和支持細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度沒有明顯差異. F: P0期OC的發(fā)育完成，各種結(jié)構(gòu)都已形成.G-G″:Gata3表達(dá)在野生型小鼠毛細(xì)胞核內(nèi).H-H″:E15.5時(shí)Gata3-Null小鼠毛細(xì)胞內(nèi)的GATA3表達(dá)于核外.I-I″:P5時(shí)鄰近毛細(xì)胞底部的支持細(xì)胞與外側(cè)的支持細(xì)胞相比較表現(xiàn)出Gata3表達(dá)降低的情況.J-J′和K-K′：P5時(shí)毛細(xì)胞和支持細(xì)胞Gata3表達(dá)差異的放大圖.#所示為內(nèi)毛細(xì)胞，+所示為外毛細(xì)胞，^所示為支持細(xì)胞所示比例尺為20 μm.

2.3 條件性敲除Gata3后對(duì)耳蝸其他細(xì)胞和結(jié)構(gòu)的影響

已有多項(xiàng)研究確認(rèn)內(nèi)耳的發(fā)育受眾多基因的調(diào)控，其中有很多重要的轉(zhuǎn)錄因子[3, 23-28].Sox2(編碼Sry-related HMG box transcription factor)基因隸屬于Sox轉(zhuǎn)錄因子家族，是耳蝸毛細(xì)胞(聽覺受體細(xì)胞)發(fā)育的關(guān)鍵基因，對(duì)毛細(xì)胞祖細(xì)胞的增殖有重要影響[29].Sox2在毛細(xì)胞和支持細(xì)胞中的表達(dá)不一致，提示OC細(xì)胞分化和結(jié)構(gòu)形成過程中Sox2受其他因素的影響.本研究發(fā)現(xiàn)，在E15.5敲除Gata3后(圖2H-H″)，P0前Gata3-Null小鼠Sox2的表達(dá)模式與野生型無明顯差異.雖然E18.5時(shí)野生型小鼠毛細(xì)胞已經(jīng)停止表達(dá)Sox2(圖 3A-A″；a-a″)；但在P0時(shí)Gata3-Null小鼠內(nèi)毛細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)Sox2(圖 3B-B″；b-b″).提示Gata3基因在決定毛細(xì)胞命運(yùn)和維持其結(jié)構(gòu)和功能方面有比較廣泛和關(guān)鍵的影響.

A-A″:P0期的Gata3-Null小鼠的毛細(xì)胞被MYO7A標(biāo)記,位置在細(xì)胞質(zhì)內(nèi).此時(shí)Sox2只在內(nèi)毛細(xì)胞核內(nèi)表達(dá),用粉色箭頭指示.a-a″為A的局部放大圖.B-B″:P0期野生型小鼠的毛細(xì)胞被MYO7A標(biāo)記.此時(shí)Sox2在毛細(xì)胞核內(nèi)不表達(dá).粉色箭頭所指為內(nèi)毛細(xì)胞核所在位置.b-b″為B的局部放大圖.所示比例尺為20 μm.圖3 條件性敲除后Gata3對(duì)其他轉(zhuǎn)錄因子基因的影響Fig.3 Effects on other transcription factor genes in the cochlea after conditional knockout of Gata3A-B:用wholemount分別顯示P23時(shí)突變體和野生型小鼠的耳蝸中段(middle)部分毛細(xì)胞的分布情況.E:所示為耳蝸wholemount整體結(jié)構(gòu)深紅色線段指示耳蝸basal, middle & apex的大致分界;黃色透明框表示CD取材的位置.F:對(duì)A-B的毛細(xì)胞數(shù)量做的對(duì)比和統(tǒng)計(jì)n=3.所示比例尺為20 μm.圖4 Gata3缺失對(duì)成體耳蝸毛細(xì)胞數(shù)量和排列的影響Fig.4 Effects of Gata3 deletion on the number and arrangement of adult cochlear hair cells

2.4 Gata3 缺失導(dǎo)致毛細(xì)胞數(shù)量減少和排列紊亂

已有的研究發(fā)現(xiàn)GATA3的缺失導(dǎo)致內(nèi)耳和聽覺神經(jīng)的形態(tài)學(xué)變異[30-31].胚胎早期Gata3在耳蝸的感覺區(qū)域表達(dá)，并調(diào)節(jié)螺旋神經(jīng)節(jié)(SGN)的存活，可能是人類HDR綜合征的分子機(jī)制[32].Gata3在胚胎發(fā)育后期和出生后持續(xù)表達(dá)在毛細(xì)胞內(nèi)；此現(xiàn)象雖然提示Gata3在毛細(xì)胞的后期發(fā)育成熟及功能和結(jié)構(gòu)維持中起到作用，但其細(xì)胞學(xué)機(jī)制一直不清楚.本研究發(fā)現(xiàn)，E15.5時(shí)敲除Gata3后到出生后5 d(P5)，毛細(xì)胞及其所在OC形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)正常.但本研究觀察到P23時(shí)，Gata3-Null小鼠毛細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且失去了有序排列方式(圖 4A-D).其中內(nèi)毛細(xì)胞的減少尤其明顯(圖 4F).同時(shí)選取了Gata3-Null和野生型小鼠耳蝸的wholemunt結(jié)構(gòu)中區(qū)(middle)部分(圖 4)，以毛細(xì)胞的標(biāo)記物Parvalbumin顯示毛細(xì)胞的數(shù)量和排列方式，觀察和統(tǒng)計(jì)了二者之間的差別.

3 討論

本研究中使用的Gata3loxp/loxp;Gfi1cre/+小鼠可以存活、繁育，且外觀和行為沒有遺傳缺陷.免疫熒光分析胚胎期和P5前毛細(xì)胞的發(fā)育狀況，發(fā)現(xiàn)Gata3loxp/loxp;Gfi1cre/+小鼠耳蝸的毛細(xì)胞與野生型小鼠相比沒有明顯差異.免疫熒光分析確認(rèn) E15.5至P5期間，毛細(xì)胞中的Gata3可以被敲除.支持細(xì)胞中Gata3的表達(dá)量有所下降，但毛細(xì)胞的數(shù)量和排列并沒有發(fā)生改變.P23耳蝸wholemount免疫熒光分析，發(fā)現(xiàn)Gata3-Null小鼠與野生型小鼠相比毛細(xì)胞的數(shù)量明顯下降，且排列紊亂.表明GATA3對(duì)成體耳蝸毛細(xì)胞和結(jié)構(gòu)維持起到重要作用.需進(jìn)一步研究Gata3對(duì)其他基因的影響和相應(yīng)的作用機(jī)制.

Sox2是成熟OC支持細(xì)胞的標(biāo)記，在P0后只在支持細(xì)胞表達(dá)[3].本研究發(fā)現(xiàn)P0內(nèi)毛細(xì)胞延遲表達(dá)

SOX2.Sox2在神經(jīng)管細(xì)胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)祖細(xì)胞增殖過程中表達(dá)[12].然而，在祖細(xì)胞退出細(xì)胞周期，進(jìn)入G0期的過程中Sox2的表達(dá)會(huì)下調(diào)，其與GATA3的交互作用可能在P0體現(xiàn)出來，并對(duì)后期的OC結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響.

本研究發(fā)現(xiàn)Gata3對(duì)成體的耳蝸毛細(xì)胞的數(shù)量和排列方式的維持有重要作用，提示進(jìn)一步研究的必要性.GATA3對(duì)成體耳蝸，特別是對(duì)高齡小鼠耳蝸的影響，需要更多的數(shù)據(jù)，研究結(jié)果將對(duì)人類早老性耳聾和人類HDR綜合征的機(jī)制研究提供線索.