王綠平，張京佶，殷浩文

上海市檢測中心生物與安全實驗室，上海 201203

生態(tài)毒理學中，魚類作為水生生態(tài)環(huán)境體系中的頂級脊椎動物，在化學品毒性研究及環(huán)境風險評估中，具有重要的作用和意義。然而，隨著替代(Replacement)、減少(Reduction)、優(yōu)化(Refinement)(3Rs)原則[1]在哺乳動物毒性測試中得到廣泛認可，近年來，該理念在環(huán)境毒理學領(lǐng)域也逐漸被關(guān)注[2]。歐盟分別于2009年和2013年，禁止用化妝品原料進行脊椎動物試驗以及禁止銷售用動物試驗檢測的化妝品原料及成品。此外，歐洲《化學品的注冊、評估、授權(quán)和限制》(REACH)法規(guī)也高度關(guān)注化學品毒性測試中實驗動物福利問題，提倡減少測試中脊椎動物的數(shù)量，推動非動物測試(如胚胎、細胞和組織等)和替代策略的開發(fā)和驗證。

采用魚類胚胎測定化學品的毒性除了可滿足現(xiàn)行動物福利法規(guī)的要求，同時具有材料方便易得、操作簡單、可重復性及可靠性較高等優(yōu)點，而且與傳統(tǒng)的魚類急性實驗相比，成本低，影響因素少，靈敏度更高，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于化合物的致毒和致畸效應(yīng)研究。

稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)是我國特有的一種小型鯉科魚類[3]，也是我國化學品環(huán)境管理中首選試驗魚種。其親魚性成熟時間短，繁殖季節(jié)長，產(chǎn)卵量大，可常年人工繁殖，因此，具有成為中國特有模式魚種的潛能。由于其胚胎也具有光學透明性，可透過卵膜清晰觀察胚胎發(fā)育，同時其胚胎的形態(tài)特征、發(fā)育過程及孵化時間也與多數(shù)淡水硬骨魚類似[4]，因此，以稀有鮈鯽為實驗材料，開展相關(guān)的胚胎毒理學研究有一定的基礎(chǔ)依據(jù)。此外，稀有鮈鯽生物學特征研究已較為系統(tǒng)，研究工作涉及魚病學、遺傳學、環(huán)境科學、胚胎學和生理學等領(lǐng)域[5-9]。在此基礎(chǔ)上，開展稀有鮈鯽在胚胎領(lǐng)域的毒理學研究將推動我國特有標準試驗魚種用于生態(tài)毒性測試的可持續(xù)戰(zhàn)略，拓展稀有鮈鯽在毒性測試中的使用范圍，為其最終成為國際公認的標準試驗物種創(chuàng)造條件。

采用魚類胚胎進行相關(guān)毒性測試試驗，如《OECD化學品測試準則No.236魚類胚胎急性毒性試驗》[10]、《OECD化學品測試準則No.210魚類早期生活階段毒性試驗》[11]、《OECD化學品測試準則No.212魚類胚胎-卵黃囊吸收階段的短期毒性試驗》[12]等，均要求在魚卵受精后盡可能快地開始試驗，胚胎應(yīng)盡量在囊胚分裂前暴露于試驗溶液中，最晚不能晚于16細胞期(距受精時間115 min)。而養(yǎng)殖的稀有鮈鯽，產(chǎn)卵活動一般發(fā)生在傍晚至午夜(18:00—24:00)之間，產(chǎn)卵持續(xù)2～4 h。夏季產(chǎn)卵時間較晚，而初春、秋末及冬季產(chǎn)卵時間較早。在陰雨天也偶見中午、下午產(chǎn)卵[8]。

本研究以稀有鮈鯽胚胎為試驗材料，研究稀有鮈鯽胚胎在實驗室條件下和室內(nèi)模擬環(huán)境條件下的自然孵化率和受精率，獲得產(chǎn)生足量、高質(zhì)量和適用于試驗的稀有鮈鯽胚胎的孵化條件，為魚類胚胎急性毒性試驗、魚類早期生活階段毒性試驗、魚類胚胎-卵黃囊吸收階段的短期毒性試驗等胚胎相關(guān)毒性試驗研究提供足量和高質(zhì)量的胚胎。同時，為稀有鮈鯽成為國際認可的中國標準試驗魚種奠定基礎(chǔ)，為國內(nèi)相關(guān)檢測標準的建立提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗動物

本研究中所使用的稀有鮈鯽源自中國科學院水生生物研究所構(gòu)建的稀有鮈鯽IHB系(野生封閉群)或引種后自行繁育。實驗室馴養(yǎng)條件下的稀有鮈鯽無肉眼可觀察的感染或疾病，且未經(jīng)任何藥物處理。試驗所使用的親魚已繁殖至少2次以上，以保證有良好的受精率。單次試驗所用胚胎均為同一批次，細胞期均為16細胞期以內(nèi)。

1.2 儀器設(shè)備及器皿

體視顯微鏡(Lumar V12，卡爾蔡司，德國)；人工氣候箱(QHX-400BS-III，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；多參數(shù)水質(zhì)分析儀(WTW Multi 3430，賽默飛世爾，美國)；吸管(3 mL)；培養(yǎng)皿(Φ=60 mm)。

1.3 試驗用水

試驗用水為經(jīng)活性炭過濾、紫外滅菌的自來水，并在恒溫儲水箱中連續(xù)曝氣至氧飽和，恒溫(26±1) ℃。水硬度為100～300 mgL-1(以CaCO3計)，pH為6.5～8.5，試驗期間變化不超過1.5個單位。

1.4 試驗方法

1.4.1 稀有鮈鯽胚胎的自然受精率和孵化率

試驗設(shè)為正常光照組和光照周期顛倒組。正常光照組光照為自然光照(光照12～16 h)，水溫維持在21～25 ℃范圍內(nèi)。光照周期顛倒組晝夜由定時器控制，提供12 h(光)∶12 h(暗)的循環(huán)光照，早上7:00至下午7:00為黑暗，下午7:00至第2天早上7:00為光照，水溫維持在21～25 ℃范圍內(nèi)。正常光照組和光照周期顛倒組稀有鮈鯽親魚均按雌雄分別馴養(yǎng)在不同的玻璃水族箱中，雌雄親魚各2個水族箱，每日均投喂冷凍高維大赤蟲2次(早晚各1次)。所有親魚均已性成熟，繁殖次數(shù)超過3次，且胚胎的受精率達90%以上。

試驗用魚卵以分組產(chǎn)卵方式獲得，按雌雄比例1∶2將6尾性成熟的稀有鮈鯽親魚，即分別從雌性親魚馴養(yǎng)水族箱和雄性親魚馴養(yǎng)水族箱中取出2尾和4尾親魚，光照周期顛倒組于試驗當天早晨7:00置于交配盒中，正常光照組于試驗前一天16:00置于親魚繁殖用交配盒中，為防止親魚捕食魚卵，在交配盒中放入網(wǎng)架(孔徑大小約為(2±0.5) mm)。正常光照組于試驗當天早上取出親魚，收集魚卵；光照周期顛倒組待燈光轉(zhuǎn)暗后2～3 h，取出親魚，收集魚卵。產(chǎn)卵結(jié)束后，將親魚雌雄分開放回原馴養(yǎng)水族箱中。

收集獲得的稀有鮈鯽胚胎，將所有胚胎用吸管移至培養(yǎng)皿中，在溫度維持在24～26 ℃范圍內(nèi)的顯微鏡房于放大倍數(shù)為40倍的體視顯微鏡下進行鏡檢并計算胚胎總數(shù)(n)。后將胚胎放置于溫度維持在25～27 ℃之間，光照周期為12 h(光)∶12 h(暗)的人工氣候箱中進行實驗，實驗周期為96 h。24 h后，于體視顯微鏡下鏡檢并計算未受精(卵黃凝結(jié)，圖1)的胚胎數(shù)(x)，計算稀有鮈鯽在正常光照條件下和光照周期顛倒條件下的自然受精率((n-x)/n×100%)；96 h后，觀察和計算胚胎的孵化數(shù)(h)，并計算孵化率(h/(n-x)×100%)。

本試驗重復進行9次，試驗頻率為7 d，每次試驗均從相同的親魚馴養(yǎng)水族箱中取出雌雄親魚進行試驗。

1.4.2 稀有鮈鯽胚胎發(fā)育時序及特征

收集正常光照組和光照周期顛倒組自然受精的稀有鮈鯽胚胎，選擇受精時間不超過30 min的魚卵，用吸管移至培養(yǎng)皿中。參考文獻[13](表1)，在放大倍數(shù)為40倍的體視顯微鏡下定期觀察并拍攝魚類胚胎發(fā)育的全過程，即從受精后分裂2細胞期至仔魚孵出，試驗持續(xù)96 h。試驗期間，胚胎培養(yǎng)溫度維持在25～27 ℃之間，光照周期為12 h(光)∶12 h(暗)，并在整個觀察過程中保持環(huán)境條件的穩(wěn)定。顯微鏡房間溫度維持在24～26 ℃之間，每次觀察時間為30～60 min。

圖1 未受精胚胎(卵黃凝結(jié))Fig. 1 Unfertilized embryo of Gobiocypris rarus (yolk condensation)

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 稀有鮈鯽胚胎的自然受精率和孵化率

正常光照和光照周期顛倒條件下，稀有鮈鯽胚胎的96 h自然受精率和孵化率試驗結(jié)果如表2和表3所示。結(jié)果表明，正常光照條件下，9次重復試驗中4次未產(chǎn)生胚胎，其余5次均產(chǎn)生胚胎。5次產(chǎn)生胚胎中2次的胚胎自然受精率和孵化率均為0，其余3次胚胎的自然受精率在80.0%～87.4%之間，平均值為83.8%，變異系數(shù)(CV)為4.42%；孵化率在61.7%～76.8%之間，平均值為69.0%，CV為11.0%。光照周期顛倒條件下，9次重復試驗的自然受精率在80.3%～98.5%之間，平均值為92.2%，變異系數(shù)(CV)為5.65%；96 h自然孵化率在80.0%～100%之間，平均值為92.8%，CV為6.21%。由結(jié)果可知，在光照周期顛倒和(26±1) ℃條件下，稀有鮈鯽胚胎自然受精率和96 h孵化率的平均值均可達到90%以上，完全可滿足魚類胚胎急性毒性試驗中對試驗用胚胎總受精率≥70%、96 h空白對照組孵化率≥80%的要求。此外，9次試驗的受精率與孵化率CV均<10%，表明試驗結(jié)果穩(wěn)定，重復性好。光照周期顛倒條件下，稀有鮈鯽胚胎的自然受精率和孵化率比正常光照條件下稀有鮈鯽胚胎的自然受精率和孵化率高，這可能是因為正常光照條件下馴養(yǎng)的稀有鮈鯽親魚受外界環(huán)境干擾大，且環(huán)境相對不夠安靜，光照時間不穩(wěn)定等，有待后續(xù)進一步研究證實。

表1 稀有鮈鯽發(fā)育時序及主要形態(tài)特征[13]Table 1 Developmental timing and morphological fearures of Gobiocypris rarus[13]

表2 正常光照條件下稀有鮈鯽胚胎的自然受精率和孵化率((26±1) ℃)Table 2 Natural fertility and hatchability of Gobiocypris rarus embryo under normal illumination conditions ((26±1) ℃)

表3 光照周期顛倒條件下稀有鮈鯽胚胎的自然受精率和孵化率((26±1) ℃)Table 3 Natural fertility and hatchability of Gobiocypris rarus embryo under illumination cycle reversal conditions ((26±1) ℃)

2.2 稀有鮈鯽胚胎發(fā)育時序及特征

2.2.1 表觀特征

肉眼觀察稀有鮈鯽胚胎呈圓形(圖2)，遇水后略微膨脹，飽滿且具有彈性。卵殼膜無色透明，易于看清胚體發(fā)育進展和活動狀況。卵膜有粘性，可粘沉于容器底部，不易隨水流波動。隨著孵化的進行，卵膜的粘性逐漸減弱。卵膜的粘性可使胚胎得以固定，便于在體視顯微鏡下觀察。最新的研究表明，稀有鮈鯽卵膜的粘性也可以通過次氯酸鈉浸泡進行消除，進而方便胚胎轉(zhuǎn)移。稀有鮈鯽的胚胎外觀無極性，卵膜徑均>1 mm，卵膜徑的大小與水體的硬度(或離子濃度)有很大的關(guān)系[15]。

2.2.2 胚胎發(fā)育時序及特征

在放大倍數(shù)為40倍的體視顯微鏡下觀察正常光照組和光照周期顛倒組的稀有鮈鯽胚胎發(fā)育過程。結(jié)果顯示，2種條件下獲得的受精卵的發(fā)育時序和特征相同，均包含卵裂期、囊胚期、原腸期、分裂期、成形期和孵化期等發(fā)育時期。圖3為光照周期顛倒條件下稀有鮈鯽胚胎的各發(fā)育時期。稀有鮈鯽胚體體表的色素顯著少于斑馬魚，在體視顯微鏡下可清楚觀察胚胎內(nèi)發(fā)育狀況和胚胎的形態(tài)異常特征。

圖2 稀有鮈鯽胚胎的表觀特征Fig. 2 Appearance features of Gobiocypris rarus embryo

圖3 光照周期顛倒條件下稀有鮈鯽胚胎發(fā)育時序及特征((26±1) ℃)注：(a). 2細胞期；(b). 4細胞期；(c). 多細胞期；(d). 囊胚早期；(e). 囊胚中期；(f). 囊胚晚期；(g). 原腸早期；(h). 原腸中期；(i). 原腸晚期；(j). 胚孔封閉；(k). 眼基；(l). 眼囊；(m). 尾鰭；(n). 肌肉效應(yīng)；(o). 心臟搏動；(p). 眼灰；(q). 眼黑；(r). 孵出。Fig. 3 Developmental timing and characteristics of Gobiocypris rarus embryo under illumination cycle reversal condition ((26±1) ℃)Note: (a).two-cell stage; (b). four-cell stage; (c). multicellular stage; (d). early blastula; (e). mid-blastula; (f). late blastula; (g). early gastrula; (h). mid-gastrula; (i). late gastrula; (j). closure of blastopore; (k). optic rudiment; (l). optic vesicle; (m). caudal fin; (n). muscular contraction; (o). heart pulsation; (p). greyish eyes; (q). melanoid eyes; (r). hatching.

觀察發(fā)現(xiàn)，稀有鮈鯽的胚胎發(fā)育過程與多數(shù)淡水硬骨魚類相似。卵受精后30 min即在動物極形成胚盤，10 min后以縱裂的方式開始進行胚胎分裂，逐步分裂成2細胞、4細胞等(圖3(a)和(b))，胚層逐漸隆高。經(jīng)多次分裂，多層分裂球迭加如桑葚，在動物極隆起呈小丘狀(圖3(c))。卵裂局限在動物極所在半球，分裂球的大小相近，高度約占整個卵垂徑的1/3以上，整個卵裂期持續(xù)約3 h。胚胎多層分裂后分裂球難以分辨，胚層隆起較高，即囊胚早期(圖3(d))。隨著胚層的變薄并逐漸下降，卵黃囊內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)減少直至消失，整個胚胎呈正圓球形，囊胚期結(jié)束，時間持續(xù)190 min(圖3(e)和(f))。原腸期胚層以內(nèi)卷和下包的方式形成原腸胚。胚層下包1/2、2/3～3/4和4/5分別為原腸早期、中期和晚期，時間持續(xù)210 min(圖3(g)、(h)和(i))。當胚層下包8/9，胚基形成后胚孔封閉(圖3(j))。卵受精后約17 h，胚胎出現(xiàn)側(cè)條眼基痕跡，肌節(jié)4對(圖3(k))，有些胚胎明顯可見被一層似膜結(jié)構(gòu)包裹著，約90 min后眼基擴大成豆形眼囊，肌節(jié)7對(圖3(l))。胚胎發(fā)育約25 h后，尾段伸展形成尾鰭，卵黃囊被略拉長，肌節(jié)23對(圖3(m))；持續(xù)發(fā)育3 h后，在體視顯微鏡下可見胚體輕微抽動，卵黃囊前部圓球形，后段隨尾生長而進一步拉長(圖3(n))。卵受精后34 h左右，心臟形成并緩緩博動(圖3(o))。卵受精后約51 h，眼囊變灰色，其正下方有一極小黑色素點，卵黃囊背前出現(xiàn)淺的黑色素化(圖3(p))，約8 h后眼全黑，體各部出現(xiàn)黑色素，卵黃囊背面黑色素加深(圖3(q))。卵受精后72 h，80%仔魚孵出(圖3(r))，96 h時100%仔魚孵出。剛孵出的仔魚，體呈草黃色，卵黃囊前部圓球形，后段細棒狀，眼睛全黑，體表黑色素密布，胸鰭的大小和幼魚的接近，鰓弧形成，口裂出現(xiàn)，消化道貫通并出現(xiàn)鰾雛形。

有的未受精卵產(chǎn)生不規(guī)則卵裂，不能繼續(xù)發(fā)育；有的則不產(chǎn)生卵裂。約在同批受精卵發(fā)育至2～4細胞時開始，至囊胚期前后，陸續(xù)有未受精卵胚盤向卵黃囊中下陷直至湮沒，卵黃囊隨之變形、解體，整個過程約2 h(圖4)。

當水溫為(25±0.5) ℃時，稀有鮈鯽孵化時間約為75 h；當溫度變化在22.0～28.0 ℃時，所需時間為89 h[9]；斑馬魚在25 ℃條件下，其胚胎孵化時間約為88 h[16]。因此，稀有鮈鯽胚胎發(fā)育時序及特征符合胚胎試驗觀察的需求，與斑馬魚基本一致，可在特定的時間點觀察特定表征[17-18]。此外，在胚胎急性毒性試驗要求的溫度下(25～27 ℃)，稀有鮈鯽胚胎孵化時間<96 h，滿足試驗周期內(nèi)空白對照組孵化率≥80%的要求。

圖4 體視顯微鏡下分裂異常的稀有鮈鯽胚胎Fig. 4 Embryo of Gobiocypris rarus with abnormal division under stereoscopic microscope

綜上所述：稀有鮈鯽作為卵生魚類，在光照周期顛倒條件下，其自然受精率與孵化率均較高，具有開發(fā)胚胎毒性試驗的潛力。其胚胎的形態(tài)特征(卵大透明，沉降于容器底部)滿足胚胎試驗觀察的需求，可在特定的時間點觀察特定表征；此外，稀有鮈鯽胚胎溫度適應(yīng)性廣，有研究表明，稀有鮈鯽在水溫13.0～31.6 ℃均能完成正常胚胎發(fā)育，通過控制水溫，可提高或延遲其孵化時間[8]，這為稀有鮈鯽用作胚胎研究的試驗材料提供了便利。在魚類胚胎試驗要求的溫度下((26±1) ℃)，稀有鮈鯽胚胎孵化時間<96 h，且孵化率超過80%，滿足魚類胚胎試驗對受試生物生命周期的界定以及試驗有效性。