姬海南，李海山，宋乃寧，徐寶梁，趙潺，李文濤，沈國(guó)林

中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院化學(xué)品安全研究所，北京 100123

目前，環(huán)境污染已經(jīng)是一個(gè)全球性的話(huà)題，尤其是隨著工業(yè)化生產(chǎn)的進(jìn)一步發(fā)展，工業(yè)污染物大量排放，惡性腫瘤、遺傳性疾病以及男性不育等疾病發(fā)生率逐年上漲，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disrupters, EEDs)亦稱(chēng)環(huán)境激素，是一大類(lèi)存在于環(huán)境中的外源性化學(xué)物質(zhì)，大多具有類(lèi)雌激素樣作用，能夠破壞機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和協(xié)調(diào)，干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常發(fā)育[1-2]。雙酚A(BPA)是備受關(guān)注的內(nèi)分泌干擾物之一，具有弱雌激素效應(yīng)[3-4]，能擾亂人類(lèi)和野生動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能，損傷再生機(jī)能和產(chǎn)生惡性腫瘤，從而可能對(duì)人類(lèi)健康和野生動(dòng)物構(gòu)成極大的威脅[5]。BPA是生產(chǎn)聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹(shù)脂的主要原料[6-7]，BPA不與聚合物的大分子共價(jià)結(jié)合，并且易于遷移到食品和飲料中[8-11]。BPA通過(guò)口腔和皮膚等途徑進(jìn)入動(dòng)物或人體內(nèi)后[12]，將干擾機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能，影響機(jī)體內(nèi)的激素代謝，進(jìn)而對(duì)機(jī)體的生殖、發(fā)育和認(rèn)知甚至惡性腫瘤的發(fā)生等多方面產(chǎn)生影響[13-17]。目前，BPA的低劑量效應(yīng)備受關(guān)注，但其毒作用機(jī)制尚不清楚，因此，研究低濃度BPA對(duì)小鼠內(nèi)源性物質(zhì)的影響對(duì)其引起的健康風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估具有重要意義。

近年來(lái)，代謝組學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于環(huán)境毒理作用機(jī)制的研究[18-19]。使用高分辨質(zhì)譜進(jìn)行代謝組學(xué)分析，生物樣品不需要衍生化，并且能夠檢測(cè)眾多的化合物，已成為非靶標(biāo)代謝產(chǎn)物分析的有效方法。采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC-MS/MS)[20-22]法進(jìn)行不同染毒劑量BPA的代謝組學(xué)研究的相關(guān)報(bào)道較少，因此，本研究采用代謝組學(xué)技術(shù)，尋找與BPA相關(guān)的生物標(biāo)志物，并分析BPA對(duì)小鼠紊亂代謝通路的影響，揭示小鼠體內(nèi)可能受到影響的代謝途徑，以期進(jìn)一步闡明BPA對(duì)機(jī)體的毒性作用機(jī)制，同時(shí)，尋求BPA的潛在生物靶點(diǎn)，為BPA毒性的有效快速檢測(cè)提供一種新方法。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

DV215CD電子分析天平(Sartorius公司，德國(guó))、電子天平(Mettler Toledo公司，瑞士)、-80 ℃冰箱(Thermo Fisher公司，美國(guó))、DIONEX Ultimate 3000超高效液相色譜儀(Themo Fisher公司，美國(guó))、Thermo Q EXACTIVE質(zhì)譜儀(Themo Fisher公司，美國(guó))、C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)色譜柱(Thermo Syncronis公司，美國(guó))、Milli-Q AdvantageA10型超純水儀(Millipore公司，美國(guó))、KQ-250超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，中國(guó))和X-30R型離心機(jī)(Sigma公司，德國(guó))，甲酸(色譜純)、甲酸銨(色譜純)、甲醇(色譜純)和乙腈(色譜純)均購(gòu)自美國(guó)Themo Fisher公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL6小鼠，雄性，體重約18～22 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房中，實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，自由飲水。

1.3 染毒實(shí)驗(yàn)

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，設(shè)置1個(gè)對(duì)照組和4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，染毒劑量分別為1、10、50和250 μg·kg-1，每天灌胃染毒一次，連續(xù)14 d。末次染毒后，空腹，眼球靜脈取血放置于預(yù)放肝素鈉的離心管中，5 000 g離心10 min，取血漿凍存于-80 ℃冰箱。

1.4 血漿樣品處理

分析前將血漿樣品于室溫下解凍，取50 μL，加入乙腈450 μL，渦流30 s，13 000 r·min-1離心15 min，取上清液直接進(jìn)樣分析。

1.5 色譜條件

Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀，色譜柱為T(mén)hermo Syncronis C18 (2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm)；流動(dòng)相A為水(含0.1%甲酸(體積比)和2 mmoL·L-1甲酸銨)，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫條件：0～1 min，95% A；1～5 min，95%～40% A；5～8 min，40%～0% A；8～11 min，0% A；11～14 min，0%～40% A；11～15 min，40%～95% A；15～18 min，95% A。

1.6 質(zhì)譜(MS/MS2)條件

電噴霧離子源(ESI)，采用正負(fù)離子同時(shí)掃描模式，電噴霧電壓2.8 kV；鞘氣流速為35 arb，輔助氣流速為10 arb，毛細(xì)管溫度320 ℃；一級(jí)全掃描(full scan)：分辨率為70 000，掃描范圍為50～1 050 (m/z)；二級(jí)數(shù)據(jù)依賴(lài)性?huà)呙?full MS/dd-MS)：分辨率為17 500，Stepped NCE值為20、40和60 V。

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析

采用mzcloud對(duì)小鼠血漿內(nèi)源性代謝物質(zhì)進(jìn)行鑒定，利用分子式和分子量及二級(jí)離子碎片確定內(nèi)源性物質(zhì)，同時(shí)在Trace Finder軟件中自建內(nèi)源性物質(zhì)[22]，在Metlin(http://metlin.scripps.edu/)、HMDB(www.hmdb.ca)[23]和KEGG[24-25](www.genome.jp/kegg/ligand.html)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索和確認(rèn)。本實(shí)驗(yàn)采用Meta boanalyst 3.3.0進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA)、偏最小二乘判別分析(partial least squared discriminant)和拓?fù)浞治?，使用R統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析(R×64 3.2.4(http://cran.r-project.org))，從而進(jìn)行高通量代謝通路分析[26]。最后用Cytoscape(http://www.cytoscape.org)、Metsape和MCL或MCODE(http://bad erlab.org/Software/MCODE)插件繪圖并進(jìn)行內(nèi)源性物質(zhì)網(wǎng)絡(luò)圖模塊化分析。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 血漿總離子圖及鑒別方式

血漿樣品總離子圖及鑒別方式，如圖1所示。

圖1 (a)一級(jí)正離子全掃描特征的血漿樣品總離子流圖；(b)一級(jí)負(fù)離子全掃描特征的血漿樣品總離子流圖；(c)纈氨酸色譜圖；(d)纈氨酸相應(yīng)的精確質(zhì)量數(shù)和分子式Fig. 1 (a) Total ion current chromatography (TIC) of plasma samples derived from positive ion scanning; (b) Total ion current chromatography (TIC) of plasma samples derived from the negative ion scanning; (c) Valine chromatogram; (d) The exact mass and molecular formula of valine

2.2 多變量分析各組小鼠血漿UHPLC-MS/MS數(shù)據(jù)的模式識(shí)別

2.3 潛在生物標(biāo)志物的鑒定

PLS-DA分析后，結(jié)合VIP>1及P<0.05的篩選條件篩選出潛在的生物標(biāo)志物。并與文獻(xiàn)進(jìn)行比較，共鑒定出27個(gè)潛在的生物標(biāo)志物，其質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息如表1和表2所示。

表1 主要內(nèi)源性代謝物的平均變化(VIP>1)Table 1 The average changes of main metabolites (VIP>1)

與對(duì)照組相比，各個(gè)染毒劑量組中亞油酸、β-羥基丁酸、棕櫚酸、二十二碳六烯酸、膽固醇硫酸鹽、花生四烯酸、十六烷丙氨、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、三甲胺N-氧化物、亞精胺、丙三羧酸和丙酮酸的含量均明顯降低，并隨劑量的增加，降低趨勢(shì)更加明顯，L-纈氨酸、丁烯基肉堿、3-甲基-2-氧戊酸、谷氨酰胺、L-乙酰肉堿、L-亮氨酸和肌酸的含量均明顯升高，并隨劑量的增加，升高趨勢(shì)更加明顯；植物鞘胺醇和β-羥基異戊酸的含量，隨劑量的增加，先升高后降低；亞油酸肉堿、尼克酰胺的含量，隨劑量的增加，先降低后升高。這些代謝產(chǎn)物的變化差異預(yù)示著小鼠經(jīng)受不同劑量BPA暴露后，機(jī)體代謝功能發(fā)生了紊亂。

2.4 血漿數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析與分層聚表類(lèi)分析

2.4.1 血漿差異性代謝物相關(guān)性分析結(jié)果

血漿中27個(gè)差異性代謝物相關(guān)性分析結(jié)果如圖3所示，圖3中水平軸和垂直軸均代表內(nèi)源性物質(zhì)的變量信息，顏色越深反映其內(nèi)源性物質(zhì)的相關(guān)性越強(qiáng)，顏色越淺反映內(nèi)源性物質(zhì)的相關(guān)性越弱，棕紅色表示正相關(guān)，藍(lán)綠色表示負(fù)相關(guān)，因此，由圖3可知差異性?xún)?nèi)源性代謝物之間的相關(guān)性。從橫軸看，在同一小分支下的內(nèi)源性物質(zhì)，它們的正相關(guān)性最強(qiáng)，即某一個(gè)內(nèi)源性物質(zhì)含量升高或者降低，則與之相關(guān)性強(qiáng)的內(nèi)源性物質(zhì)會(huì)隨之升高或降低。

表2 血漿內(nèi)不同內(nèi)源代謝物的相關(guān)檢測(cè)信息(VIP>1)Table 2 The related detection information about different endogenous metabolites in plasmas (VIP>1)

圖2 (a)四級(jí)桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(Q-Exactive Orbitrap-MS)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的主成分分析(PCA)模型的分析結(jié)果；(b)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的偏最小二乘法判別分析法(PLS-DA)的分析結(jié)果Fig. 2 (a) Principal components analysis (PCA) score plots for comprehensive metabolomic data of Q-Exactive Orbitrap-MS; (b) Partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) models for metabolomic data of plasma samples

圖3 生物標(biāo)志物的相關(guān)分析結(jié)果(歐幾里德距離測(cè)量法和沃爾德聚類(lèi)算法)Fig. 3 Relevant results of biomarker analysis (distance measure using Euclidean, and clustering algorithm using Ward)

2.4.2 分層聚類(lèi)分析結(jié)果

分層聚類(lèi)分析獲得的熱圖如圖4所示，其可直觀顯示出27種代謝物在各組間的含量相關(guān)性。圖4中縱向是樣品的聚集，橫向是代謝物的聚類(lèi)，聚類(lèi)枝越短代表相似性越高，從縱向聚類(lèi)可以看出樣品間代謝物含量的表達(dá)模式聚類(lèi)。顏色深淺反映代謝物之間相關(guān)性大小，紅色表示正相關(guān)，綠色表示負(fù)相關(guān)。由圖4可知，對(duì)照組與其他各組顯著分開(kāi)，各組均不在一個(gè)分支下面，其中對(duì)照組、各個(gè)劑量組之間沒(méi)有重疊，隨著染毒劑量的增加，各組逐漸遠(yuǎn)離對(duì)照組，表明BPA暴露后小鼠血漿部分內(nèi)源性代謝模式發(fā)生改變，從一定程度上說(shuō)明BPA能夠影響小鼠的代謝。

圖4 Heatmap分析各組相關(guān)的生物標(biāo)記物的結(jié)果(歐幾里德距離測(cè)量法和沃爾德聚類(lèi)算法)Fig. 4 Heatmap analysis of related biomarkers of each group (distance measure using Euclidean, and clustering algorithm using Ward)

2.5 潛在生物標(biāo)志物的代謝通路分析

利用Metabo Analyst網(wǎng)站對(duì)27個(gè)代謝產(chǎn)物進(jìn)行代謝通路的富集分析，選擇KEGG作為數(shù)據(jù)庫(kù)，代謝通路影響值的臨界值設(shè)置為0.10，高于這個(gè)值，認(rèn)為是潛在的靶標(biāo)路徑，共得到6條相關(guān)的潛在代謝靶標(biāo)路徑。它們分別為亞油酸代謝、花生四烯酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸及谷氨酸代謝、丙酮酸代謝、鞘脂類(lèi)代謝和磷酸肌醇代謝。如圖5和表3所示，在BPA染毒的過(guò)程中上述6個(gè)代謝通路受到了較大干擾。

圖5 使用MetPA數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建重要內(nèi)源性小分子相關(guān)代謝通路注：logP表示代謝通路貢獻(xiàn)值的對(duì)數(shù)(log)轉(zhuǎn)換。Fig. 5 Pathway analysis diagram obtained by MetPA showing effect of important endogenous substances on metabolic pathwaysNote: logP is the logarithm value of pathway impact.

2.6 潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模塊化的構(gòu)建及分析

網(wǎng)路中的模塊具有相似性，通過(guò)跨模塊化連接到網(wǎng)絡(luò)中相鄰模塊中各個(gè)模塊的節(jié)點(diǎn)，從而導(dǎo)致模塊邊緣之間的重疊。網(wǎng)絡(luò)模型可以表達(dá)網(wǎng)絡(luò)藥物、目標(biāo)和疾病之間復(fù)雜的關(guān)系；節(jié)點(diǎn)代表實(shí)體如基因、蛋白質(zhì)、小分子、藥物和疾病；連線代表節(jié)點(diǎn)之間的相互作用分析通過(guò)Cytoscape可視化中的Metscape模塊化進(jìn)行，共發(fā)現(xiàn)7個(gè)模塊，其中的中心圓模塊與其他6個(gè)模塊聯(lián)系最為緊密(圖6)，其中，亞油酸與丙酮酸的連線有6條，L-谷氨酰胺與丙酮酸的連線有5條，L-谷氨酰胺與L-亮氨酸的連線有3條，L-谷氨酰胺與尼克酰胺的連線有2條，花生四烯酸與3-甲基-2-氧戊酸連線有3條。這說(shuō)明，丙酮酸與之中心的模塊關(guān)系最緊密，亞油酸次之。在利用Metscape重建與BPA染毒相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上，可確定所有相關(guān)代謝物?？梢?jiàn)，此法可有效篩選出節(jié)點(diǎn)藥物的作用靶點(diǎn)。

3 討論(Discussion)

本研究借助UHPLC-MS/MS高靈敏檢測(cè)平臺(tái)嘗試從代謝潛在靶點(diǎn)的角度闡明這一復(fù)雜的病理生理過(guò)程。對(duì)這些差異代謝物的監(jiān)測(cè)有利于進(jìn)一步理解BPA對(duì)小鼠的毒性機(jī)制。

在差異代謝物中，與氨基酸代謝相關(guān)的化合物有谷氨酰胺、纈氨酸和L-亮氨酸。谷氨酰胺(L-glutamine, Gln)作為人體內(nèi)最為豐富的氨基酸之一，為供能和生物合成提供主要的碳源和氮源，具有維持機(jī)體氮平衡、保護(hù)腸黏膜屏障及改善免疫功能等多種生理生化作用。有研究表明，Gln可改善肥胖機(jī)體糖脂類(lèi)代謝，升高脂聯(lián)素(APN)水平，改善胰島素抵抗指數(shù)(IRI)[27]；經(jīng)脂多糖(LPS)刺激的巨噬細(xì)胞分泌IL-6和TNF-α的量依賴(lài)于細(xì)胞外Gln的可用量[28]。異亮氨酸、纈氨酸轉(zhuǎn)化成為葡萄糖后氧化分解，為機(jī)體提供必要的能量，參與修復(fù)組織、調(diào)節(jié)血糖和提升體能等。與對(duì)照組相比，各劑量處理組中，Gln的含量出現(xiàn)了顯著性上調(diào)。Gln是神經(jīng)興奮遞質(zhì)，含量的上調(diào)表明BPA暴露使小鼠處于一種缺氧的狀態(tài)[29]，并有可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性中毒[30]。L-纈氨酸、亮氨酸的含量出現(xiàn)了顯著性上調(diào)。已有研究表明，支鏈氨基酸對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖發(fā)揮重要作用[31]。因而，支鏈氨基酸的含量上調(diào)可能指示了對(duì)小鼠高風(fēng)險(xiǎn)的身體傷害。另一方面，已知支鏈氨基酸可調(diào)節(jié)能量代謝[32]。這些代謝產(chǎn)物的異常表明BPA可以擾亂小鼠體內(nèi)氨基酸代謝。

表3 MetPA分析代謝通路的結(jié)果(Impact>0.10)Table 3 Results from pathway analysis with MetPA (Impact>0.10)

圖6 用Metscape可視化模塊化地圖觀察7個(gè)模塊之間的連接注：節(jié)點(diǎn)的中心圓表示模塊，它們之間的邊表示模塊之間節(jié)點(diǎn)的交互，外部中心圓是每個(gè)彩色節(jié)點(diǎn)的特定模塊，深紅色節(jié)點(diǎn)是模塊的核心節(jié)點(diǎn)。Fig. 6 Module interactions visualization by the modular map obtained by Metscape to observe the connections among 7 modulesNote: Center circle of the node represents a module, and the edge between them represents the interaction of nodes among the modules; outside center circles are the specifc modules for each colored node, and the crimson nodes are the core nodes for the module.

脂類(lèi)代謝包括脂肪酸生物合成、脂肪酸伸長(zhǎng)、脂肪酸降解、酮的合成和類(lèi)固醇生物合成、花生四烯酸代謝和初級(jí)膽汁酸合成等多種途徑。β-羥基丁酸(β-hydroxy butyric acid, BHB)可代替葡萄糖為大腦提供能量[33]，也有研究表明，β-羥丁酸可減輕多巴胺能神經(jīng)元的變性并可改善線粒體呼吸功能[34]。大量的脂類(lèi)及其衍生代謝物在本次研究中被檢出，其中，油酸、棕櫚酸、二十二碳六烯酸、油酸、β-羥基異戊酸、丙三羧酸、花生四烯酸、尼克酰胺、亞油酸肉毒堿、11-十八烯基肉堿和丁烯基肉堿。染毒后，觀察到亞油酸、棕櫚酸、二十二碳六烯酸、油酸、β-羥基異戊酸、丙三羧酸、花生四烯酸、尼克酰胺、亞油酸肉毒堿、11-十八烯基肉堿和丁烯基肉堿大量減少，分析可能是因?yàn)榧?xì)胞生物膜持續(xù)被破壞，無(wú)法及時(shí)修復(fù)所致，而部分脂肪酸的減少加重了機(jī)體脂質(zhì)代謝的異常。這與BPA可能會(huì)通過(guò)干擾內(nèi)源激素來(lái)影響脂肪代謝的結(jié)果相一致。

三甲胺-N-氧化物(trimethylamine-N-oxide, TMAO)是腸道微生物和膳食磷脂酰膽堿的代謝產(chǎn)物，膽堿代謝與脂類(lèi)代謝關(guān)系密切，膽堿也是細(xì)胞膜和磷脂脂蛋白的重要組成成分，對(duì)細(xì)胞膜保持完整性及脂類(lèi)代謝發(fā)揮著重要作用[35-36]，同時(shí)，膽堿也參與脂肪代謝的平衡調(diào)控，其含量升高也是脂代謝紊亂的證據(jù)。三甲胺N-氧化是由膽堿和肉堿在腸道細(xì)菌酶作用下的降解產(chǎn)物，BPA各劑量組中三甲胺含量降低，表明腸道菌群代謝可能發(fā)生紊亂。

亞精胺是一種天然多胺，在神經(jīng)系統(tǒng)中具有調(diào)控突觸可塑性、拮抗氧化應(yīng)激和促進(jìn)自噬的作用，亞精胺不僅參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞衰老、器官發(fā)育、免疫以及癌癥等病理生理過(guò)程，在神經(jīng)系統(tǒng)中還具有調(diào)節(jié)突觸可塑性、抗氧化應(yīng)激及促進(jìn)自噬等功能。與對(duì)照組相比，各個(gè)BPA劑量組中，亞精胺的含量明顯降低，且劑量越高，降低趨勢(shì)越明顯，亞精胺代謝的異常預(yù)示BPA對(duì)機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生了影響，這與文獻(xiàn)中BPA能夠引起小鼠認(rèn)知及記憶功能障礙的報(bào)道互相印證[37]。

本研究表明，不同劑量的BPA能夠影響小鼠亞油酸代謝、花生四烯酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、丙酮酸代謝、鞘脂類(lèi)代謝和磷酸肌醇代謝，其毒性機(jī)制具有多通路、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。但本研究只觀察了血漿的代謝組學(xué)特征，需進(jìn)一步開(kāi)展尿液、各個(gè)臟器及不同周期染毒樣本的研究，以便準(zhǔn)確反映BPA的毒性作用機(jī)制。