王雪，李琳，張紅，張雪，王振華

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.生命科學(xué)學(xué)院生理學(xué)教研室，沈陽 110122；2.附屬口腔醫(yī)院干診科，沈陽 110002）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是具有高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率的惡性腫瘤，約占口腔癌的90%［1］。目前手術(shù)仍為主要治療方式，但患者術(shù)后易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，5年生存率僅為50%［2］。因此，尋找OSCC的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制十分重要。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種沒有編碼蛋白能力的RNA。越來越多的證據(jù)表明lncRNA在OSCC的進(jìn)展中發(fā)揮調(diào)控作用［3-5］。lncRNA RUNX1-IT1位于染色體21q22.12區(qū)域，長約1 502個核苷酸，研究［6-7］表明它在結(jié)直腸癌和胃癌中發(fā)揮調(diào)控作用，然而lncRNA RUNX1-IT1在OSCC中的功能和機(jī)制尚未明確。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)探討lncRNA RUNX1-IT1對OSCC增殖、遷移的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源：收集2018年5月至2019年2月期間中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科手術(shù)切除的47例OSCC癌組織和癌旁正常組織，OSCC的診斷依據(jù)組織病理學(xué)確定。標(biāo)本收集前經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并經(jīng)患者知情同意。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)：OSCC細(xì)胞系CAL27、SCC25均購于美國ATCC細(xì)胞庫。HaCaT購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫。CAL27、HaCaT以DMEM高糖培養(yǎng)基（含有10%的胎牛血清）培養(yǎng)，SCC25以DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清，400 ng/mL氫化可的松，0.5 mmol/mL丙酮酸鈉。細(xì)胞于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時qPCR：用Trizol法提取組織和細(xì)胞RNA。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用SYBRPremix Ex Taq Ⅱ在LightCycler480Ⅱ?qū)崟r PCR儀上進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)。引物序列：lncRNA RUNX1-IT1，上游引物5’-GGACACGCAGAGGAAGT CAA-3’，下游引物5’-GTTCTTGAGGTTGGCGGAGA-3’；GAPDH，上游引物5’-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物5’-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。以2-ΔΔCt法計算結(jié)果。

1.2.2 載體構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染：過表達(dá)慢病毒載體購于上海吉瑪基因公司，當(dāng)CAL27細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取CAL27分為LV5組（對照組）和LV-RUNX1-IT1組（實(shí)驗(yàn)組），用1 μg/mL嘌呤霉素構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系。SiRNA 購于廣州銳博公司，采用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染空白載體細(xì)胞為si-NC組，轉(zhuǎn)染lncRNA RUNX1-IT1沉默載體細(xì)胞為si-RUNX1-IT1組。

1.2.3 細(xì)胞增殖：細(xì)胞增殖能力用CCK8檢測。常規(guī)胰酶消化細(xì)胞后在96孔板內(nèi)接種100 μL對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液，含2 000個細(xì)胞。在37 ℃孵箱內(nèi)孵育24、48、72、96 h。每孔加入10 μL CCK8試劑孵育1 h，在450 nm波長處測定吸光度。

1.2.4 細(xì)胞周期：細(xì)胞消化后用PBS洗滌細(xì)胞（2 000 r/min，5 min）并收集，加入70%冷乙醇固定4 ℃過夜。根據(jù)細(xì)胞周期試劑盒說明書加入500 μL PI/RNaseA染色，室溫避光30～60 min后流式細(xì)胞儀采集數(shù)據(jù)并分析。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)：向Transwell小室上方加入含1×105個細(xì)胞的200 μL無血清培養(yǎng)基，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，37 ℃孵育48 h。棄掉培養(yǎng)基，將上室置于甲醇固定1 min，蘇木素染色3 min和伊紅染色15～30 s。倒置顯微鏡隨機(jī)取圖并計數(shù)。

1.2.6 Western blotting：采用全蛋白試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳后，常規(guī)轉(zhuǎn)膜。加入一抗（E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Vimentin、PCNA、Cyclin D1、MMP2、β-actin）孵育4 ℃過夜，然后加入二抗，孵育1.5 h。利用凝膠成像儀采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法分析lncRNA RUNX1-IT1表達(dá)水平和OSCC患者臨床病理資料的相關(guān)性。計量資料以表示，2組比較采用配對t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA RUNX1-IT1在OSCC 中的表達(dá)

利用實(shí)時qPCR檢測47例OSCC患者lncRNA RUNX1-IT1的表達(dá)，結(jié)果顯示，38例（81%）OSCC癌組織lncRNA RUNX1-IT1表達(dá)（6.03±2.73）顯著高于癌旁正常組織（7.04±2.75，P＜0.001）。lncRNA RUNX1-IT1在OSCC細(xì)胞系CAL27（13.19±0.92）、SCC25（8.55±1.17）表達(dá)顯著高于正常細(xì)胞系HaCaT（1.00±0.00，P＜0.01）。lncRNA RUNX1-IT1相對表達(dá)水平和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），見表1。這些結(jié)果說明lncRNA RUNX1-IT1的高表達(dá)可能在OSCC轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

2.2 lncRNA RUNX1-IT1對CAL27細(xì)胞增殖的影響

過表達(dá)和沉默lncRNA RUNX1-IT1后實(shí)時qPCR檢測轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，與LV5組（1.00±0.00）比較，LV-RUNX1-IT1組（48.44±7.33）中l(wèi)ncRNA RUNX1-IT1表達(dá)水平顯著增高（P＜0.01）；與si-NC組（1.00±0.00）比較，si-RUNX1-IT1組（0.24±0.06）lncRNA RUNX1-IT1表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。

表1 lncRNA RUNX1-IT1表達(dá)和OSCC患者臨床指標(biāo)的相關(guān)分析Tab.1 Correlation between lncRNA RUNX1-IT1 expression and clinicopathological characteristics in OSCC patients

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與LV5組比較，LV-RUNX1-IT1組在72、96 h OD值明顯增高（P＜0.05），細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng)（圖1A）；lncRNA RUNX1-IT1沉默后，si-RUNX1-IT1組在72、96 h OD值明顯降低（P＜0.05），細(xì)胞增殖活性顯著減弱（圖1B）。

圖1 lncRNA RUNX1-IT1對CAL27細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of CAL27 cell proliferation on lncRNA RUNX1-IT1

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與LV5組比較，LVRUNX1-IT1組G1期細(xì)胞顯著減少，S期細(xì)胞顯著增加；而沉默lncRNA RUNX1-IT1后細(xì)胞阻滯在G1期，G1期細(xì)胞顯著增加，S期細(xì)胞顯著減少，見圖2。

2.3 lncRNA RUNX1-IT1對CAL27細(xì)胞遷移的影響

Transwell結(jié)果顯示，LV5組、LV-RUNX1-IT1組、si-NC組、si-RUNX1-IT1組細(xì)胞遷移數(shù)量分別為110±14、214±10、109±9、54±5。與LV5組比較，LVRUNX1-IT1組CAL27細(xì)胞遷移數(shù)量增多（P＜0.01），提示過表達(dá)lncRNA RUNX1-IT1后細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)；與si-NC組比較，si-RUNX1-IT1組CAL27細(xì)胞遷移數(shù)量顯著減少（P＜0.01），提示沉默lncRNA RUNX1-IT1后細(xì)胞遷移能力顯著減弱，見圖3。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期分析結(jié)果Fig.2 Results of cell cycle analysis by flow cytometry

圖3 lncRNA RUNX1-IT1對CAL27細(xì)胞遷移的影響×200Fig.3 Effect of CAL27 cell migration on lncRNA RUNX1-IT1 ×200

2.4 過表達(dá)的lncRNA RUNX1-IT1促進(jìn)CAL27細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）

Western blotting檢測EMT相關(guān)標(biāo)志物結(jié)果顯示，過表達(dá)lncRNA RUNX1-IT1后，與LV5組比較，LV-RUNX1-IT1組上皮標(biāo)志物E-cadherin顯著減少（P＜0.01），而間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、β-catenin、Vimentin（均P＜0.05）顯著增多，促進(jìn)了上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換；沉默lncRNA RUNX1-IT1后發(fā)現(xiàn)結(jié)果與之相反，抑制了上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。PCNA、Cyclin D1和MMP2蛋白水平均在lncRNA RUNX1-IT1過表達(dá)后顯著上調(diào)；在lncRNA RUNX1-IT1沉默后顯著下調(diào)。以上結(jié)果表明lncRNA RUNX1-IT1可能通過調(diào)控EMT促進(jìn)CAL27細(xì)胞增殖和遷移，見表2、圖4。

3 討論

近年來，研究［8-10］表明，lncRNA的異常表達(dá)可能與癌癥（胃癌、卵巢癌和乳腺癌等）的預(yù)后和轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究結(jié)果顯示lncRNA RUNX1-IT1在OSCC組織和細(xì)胞中高表達(dá)，lncRNA RUNX1-IT1的表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，這說明lncRNA RUNX1-IT1高表達(dá)可能參與OSCC的轉(zhuǎn)移過程。

表2 各組EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較Tab.2 EMT-related proteins expression levels in all groups

圖4 各組EMT相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.4 Expression of EMT-related proteins in all groups

已有研究［11］顯示，lncRNA生長特異抑制物5（growth arrest-specific 5，GAS5）過表達(dá)通過激活PTEN/AKT軸抑制OSCC細(xì)胞的增殖和侵襲。lncRNA母系表達(dá)基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）吸附miR-548d-3p調(diào)節(jié)JAK-STAT通路抑制OSCC的遷移并促進(jìn)凋亡［12］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)lncRNA RUNX1-IT1促進(jìn)CAL27細(xì)胞的增殖和遷移，加快細(xì)胞從G1期向S期分化；而沉默lncRNA RUNX1-IT1抑制CAL27細(xì)胞的增殖和遷移，使細(xì)胞阻滯在G1期。

已有研究［13］認(rèn)為EMT是細(xì)胞骨架重組、上皮細(xì)胞逐漸向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，其特點(diǎn)在于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。在這個過程中，上皮標(biāo)志物（E-cadherin）減少而間充質(zhì)標(biāo)志物（N-cadherin、Vimentin）增加，使細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和運(yùn)動能力。轉(zhuǎn)錄因子Snail可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，通過降解MMP2和介導(dǎo)靶基因Cyclin D1轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移［14］。lncRNA肝癌高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本（highly upregulated in liver cancer，HULC）在OSCC中高表達(dá)，敲除HULC后抑制了EMT過程，從而影響癌細(xì)胞的增殖和侵襲［15］。本研究結(jié)果顯示過表達(dá)lncRNA RUNX1-IT1后 E-cadherin顯著減少，而N-cadherin、β-catenin、Vimentin顯著增多；沉默lncRNA RUNX1-IT1后結(jié)果與之相反。PCNA是細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白。細(xì)胞周期從G1期向S期分化時，Cyclin D1的水平發(fā)生了改變。MMP2作為MMP家族的一員在細(xì)胞發(fā)生侵襲和遷移時發(fā)揮重要作用。PCNA、Cyclin D1和MMP2的表達(dá)水平均在lncRNA RUNX1-IT1過表達(dá)后顯著上調(diào)，在lncRNA RUNX1-IT1沉默后顯著下調(diào)。以上結(jié)果提示lncRNA RUNX1-IT1誘導(dǎo)CAL27細(xì)胞EMT的發(fā)生。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)lncRNA RUNX1-IT1在OSCC組織和CAL27、SCC25細(xì)胞中顯著高表達(dá)，lncRNA RUNX1-IT1高表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、加快細(xì)胞從G1期向S期分化，促進(jìn)細(xì)胞遷移和EMT等惡性生物學(xué)行為，這為OSCC的研究提供了新的方向。