（南通大學體育科學學院公共體育教研室，江蘇 南通 226019）

阻力運動即抗阻力運動，是一種通過肌肉反復收縮對抗負荷或負重刺激所進行的運動模式。目前普遍認為足夠時間與強度的慢性阻力運動可增加肌力并促進骨骼肌肥大［1-2］。目前研究［3］表明，體內外多種因素的共同調控影響肌組織的結構和功能，從而導致肌組織的損傷或重塑。

隨著生物信息學的發(fā)展，高通量測序技術及分析方法已廣泛用于人體健康與疾病發(fā)生、發(fā)展規(guī)律及相關機制的研究。在運動系統(tǒng)領域，已有研究［4-6］探討了長期慢性或急性單次阻力運動對肌肉組織形態(tài)學及代謝的影響。然而，初次阻力運動者進行非常規(guī)阻力運動的早期，肌肉細胞的mRNA表達譜如何變化及其相關機制和潛在功能尚不明確［2］。

本研究針對未進行過阻力運動的不吸煙健康成年男性，利用高通量的基因組學分析方法分析基因數(shù)據(jù)集GSE45426，探討在初始進行阻力運動的不同階段骨骼肌mRNA表達譜的改變及其涉及的生物功能與分子機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集和分組

從美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的人類基因表達匯編（gene expression omnibu，GEO）數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載骨骼肌基因表達數(shù)據(jù)集GSE45426。研究納入的16例受試者均是未進行過阻力訓練的健康不吸煙成年男性，平均年齡（22±2）歲，體質量指數(shù)（23.0±2.0）kg/m2。受試者隨機分成運動組和對照組，每組8例。運動過程及標本檢測：受試者均采取仰臥位，膝關節(jié)屈曲90°，測定最大等長強度。（1）運動組，進行2個周期的向心性阻力運動，每個周期均在等速測力計上以坐姿進行運動，雙腿分別先后從膝關節(jié)屈曲90°～180°并且以180°/s的角速度進行5回合30次最大等速膝關節(jié)伸展，每回合間隔休息 1 min。每周期運動后 24 h采集優(yōu)勢腿肌肉活檢組織，2個周期間隔 48 h，2次活檢采集部位相距2.5 cm。（2）對照組，不做運動，但在相同時間點和對稱的部位采集肌肉活檢標本。2組飲食完全相同，具體見文獻［2］。

1.2 基因數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與功能分析

受試者骨骼肌活組織提取總RNA，應用Human Genome U133 Plus 2.0 進行基因表達微陣列分析，數(shù)據(jù)集的Series Matrix數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析（以方差最大的探針為基本單位）。應用Heat Mapper軟件制作熱圖。

應用GEO2R對運動組、對照組配對樣本（運動/對照基線時分別對比運動/對照1周期或運動/對照2周期時）分別進行差異表達基因（differential expression genes，DEG）分析［7］。log倍數(shù)變化（logFC）≥1.5且調整P＜0.05為DEG。應用Volcano Plot 繪制火山圖。

應 用Bioconductor/cluster Profiler（Ver.3.6.0）函數(shù)包對DEG涉及的生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）進行基因本體分析（gene ontology，GO）［8］。P＜0.05且FDRq＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

應用Gene Set Enrichment analysis 3.0版軟件，以運動基線對比運動2個周期為表型，先后以MSigDB在線基因集數(shù)據(jù)庫的hallmark/ KEGG/ BP gene sets作為參考基因集，對基因表達譜進行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）。隨機組合次數(shù)設置為1 000次。以P＜0.05且FDRq＜ 0.25為差異有統(tǒng)計學意義。

對有統(tǒng)計學意義的基因集進行領頭亞群基因分析。使用GPL570的注釋文件對領頭亞群基因分析所選定的探針進行注釋，利用genecards網站（www.genecards.org）匯總各個相關基因功能等信息。

2 結果

2.1 2組DEG分析

本研究中運動組運動2個周期和1個周期分別與基線（入組時）配對，共納入54 675個基因進行了配對樣本DEG分析。結果顯示，對照組各時期的骨骼肌基因表達譜無顯著差異。與基線時比較，運動組運動1個周期后基因表達無顯著差異；運動2個周期后有231個DEG，其中228個基因表達上調，3個基因表達下調，見圖1。

2.2 運動組運動2個周期后DEG的GO分析

結果顯示，與入組時比較，運動組運動2個周期后表達上調的DEG主要參與了胞外間質組織形成、炎癥反應、膠原纖維組織形成、細胞黏附、膠原代謝、骨骼系統(tǒng)發(fā)育和Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）信號通路等生物過程。表達上調的DEG主要存在于細胞外區(qū)域、間隙、間質、外泌體和膠原蛋白三聚體、蛋白質性細胞外間質、基底膜、內質網腔、血小板α顆粒腔、血液微粒和細胞表面。表達上調的DEG調控的分子功能主要包括細胞外間質組成成分調節(jié)、膠原結合、整合素結合、肝素結合等。表達下調的DEG在GO分析中無顯著陽性結果，見表1。

2.3 運動組運動2個周期后GSEA與領頭亞群基因分析

圖1 與基線時比較，運動組運動2個周期后骨骼肌中的DEG分析結果Fig.1 DEG in the skeletal muscle cells of the exercise subjects after two sessions of exercise compared to those detected at baseline

結果顯示，與入組時比較，運動組運動2個周期后標本中富集了炎癥反應、白細胞介素-6、干擾素-γ等炎癥相關通路，以及PI3K、KRAS等細胞增生通路和上皮-間質轉化、血管新生、凋亡、缺氧、P53等相關通路，見圖2。在炎癥相關通路的領頭亞群基因分析中發(fā)現(xiàn)，炎癥反應、白細胞介素-6、γ干擾素3條通路中均出現(xiàn)CXCL9、CXCL11、CXCL10、IL4R和IRF1基因，其中IRF1在3條炎癥通路和補體基因集中均可表達，見圖3。

3 討論

本研究結果顯示，從未進行過阻力運動的健康不吸煙成年男性進行2個周期阻力運動訓練后，骨骼肌中的基因表達譜與入組時相比具有顯著差異。C-C基序趨化因子配體2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）、補體成分3（complement component 3，C3）等基因表達升高。與入組時比較，表達上調的DEG大多位于細胞外區(qū)域或組織中，通過組成或結合細胞外間質成分，參與胞外間質組織調節(jié)與炎癥反應等相關生物過程；運動2個周期的骨骼肌中富集了炎癥、增生、轉化與凋亡等相關通路；而運動1個周期的骨骼肌中DEG不顯著。

表1 運動組運動2個周期后骨骼肌中顯著上調的基因表達譜的GO分析Tab.1 Gene ontology analysis of the expression profiles of genes significantly upregulated in the skeletal muscle cells of the exercise subjects after two sessions of exercise

目前認為骨骼肌可在阻力運動的刺激下發(fā)生結構與代謝等方面的改變，而且僅有＜2%的基因表達改變同時出現(xiàn)在急性單次和長期慢性阻力運動后的骨骼肌中［5］。本研究發(fā)現(xiàn)初次進行阻力運動的24 h對骨骼肌的基因表達譜無顯著影響，而間隔48 h后的再次阻力運動訓練即可顯著改變運動者骨骼肌的基因表達，導致大量基因表達上調。因而證明，骨骼肌的基因表達在阻力運動的早期即存在動態(tài)演變。已有研究［9-10］從骨骼肌代謝與分子水平證明阻力運動后的骨骼肌損傷與修復是連續(xù)的過程，本研究從基因水平進一步證實，阻力運動早期的骨骼肌除了富集炎癥反應相關通路外，還富集缺氧、血管新生、上皮-間質轉化、細胞凋亡和細胞增生等信號通路。

本研究還發(fā)現(xiàn)炎癥反應相關通路的關鍵基因包括CXCL10、CXCL9、CXCL11、IL4R和IRF1。CXCL9、CXCL10和CXCL11均屬于CXC細胞因子家族，均通過結合細胞因子受體CXCR3發(fā)揮趨化作用［11］。CXCL10又稱為γ干擾素誘導蛋白10，通過活化或記憶T細胞而發(fā)揮多重免疫功能［12-13］。人類細胞學與小鼠實驗發(fā)現(xiàn)骨骼肌損傷后CXCL10表達增加，但在骨骼肌再生的過程中不是必不可少的［14］。CXCL9是γ干擾素誘導的單核因子，為γ干擾素誘導的T細胞趨化因子［15］。在肌損傷的CXCL10敲除小鼠中CXCL9和CXCL11表達增加［14］。IL4R為Ⅰ型細胞因子受體，通過與白細胞介素-4結合，在B細胞中促進IgE產生，在T細胞中促進2型輔助T細胞分化［16-17］。目前發(fā)現(xiàn)IL4R異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關［18］。IRF1最初發(fā)現(xiàn)可以激活細胞因子γ干擾素的表達，后來證實可與干擾素刺激反應原件結合激活多種靶基因的表達，在機體免疫反應、凋亡調控、DNA損傷與腫瘤抑制等過程中發(fā)揮重要作用［19-22］。本研究結果顯示IRF1是唯一在多條炎癥相關通路中均發(fā)揮重要作用的基因。因此，CXCL10、CXCL9、CXCL11、IL4R和IRF1可能是非常規(guī)阻力運動后骨骼肌發(fā)生炎癥反應而導致?lián)p傷或再修復的關鍵基因。

圖2 運動組運動2個周期后骨骼肌中基因表達譜的GSEA結果Fig.2 The results of gene set enrichment analysis of the gene expression profile of skeletal muscle cells of the exercise subjects after two sessions of exercise

圖3 運動組運動2個周期后骨骼肌中炎癥相關通路的領頭亞群基因分析結果Fig.3 Results of the leading-edge gene analysis of the inflammation-related pathways in the skeletal muscles of the exercise subjects after two sessions of exercise

綜上所述，本研究利用生物信息學方法，基于在線數(shù)據(jù)GSE45426分析證實未進行過阻力運動的健康成年男性進行阻力運動的早期，骨骼肌在缺氧、凋亡、炎癥、血管新生與細胞增生等多重通路上同時發(fā)生基因表達譜的變化，而且這種變化多發(fā)生于骨骼肌細胞外區(qū)域或結構中。本研究對于探究阻力運動導致的骨骼肌損傷與肥大的調控機制以及進一步尋找調控靶點與措施具有重要意義。