（中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)物證教研室，沈陽 110122）

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）具有高靈敏度、高鑒別能力、高種屬特異性和易于標準化分型等優(yōu)點，目前被廣泛應(yīng)用，但其在檢測降解檢材方面表現(xiàn)出明顯不足。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）被認為是第三代遺傳標記［1-2］，大約平均每1 000 bp存在1個SNP，在人類基因組中約有300萬個SNP，其數(shù)量要比STR超出幾個數(shù)量級；多表現(xiàn)為二等位基因標記，易于分型和確定基因頻率；SNP的片段短，適合PCR擴增，分析降解DNA能力更強；遺傳標記突變率低，具有較高的穩(wěn)定性；分析方法較多，易于進行自動化分型；編碼區(qū)SNP與表型有關(guān)，研究價值大。但是，由于SNP的二等位基因性質(zhì)，多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）遠低于STR，多個SNP的集合應(yīng)用方能達到與STR相當(dāng)?shù)淖R別率。因此，發(fā)現(xiàn)多態(tài)性程度較高的SNP具有重要的法醫(yī)學(xué)意義。

磺基轉(zhuǎn)移酶（sulfotransferase，SULTs）家族參與代謝大量小型內(nèi)源性和外源性化學(xué)物質(zhì)，包括藥物、毒性化合物、類固醇激素和神經(jīng)遞質(zhì)［3］。SULT4A1基因位于22號染色體長臂（22q13.2-q13.31）［4］，序列高度保守。其編碼的磺基轉(zhuǎn)移酶與其他磺基轉(zhuǎn)移酶同源性低，但在物種間高度保守［5］，在腦內(nèi)高度表達［6］。

SULT4A1基因有多個多態(tài)性位點被報告（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），但是尚缺乏中國漢族相關(guān)的遺傳分布數(shù)據(jù)。本研究擬調(diào)查SULT4A1基因rs549267654、rs2285162、rs963263和ss2137544034位點在中國北方漢族群體的多態(tài)性分布，并探討其法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

226例中國北方漢族無血緣關(guān)系健康個體血液樣品由中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院提供，樣品提供者均簽署知情同意書，倫理批件號為［2016］063。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及定量：酚/氯仿法提取全血基因組DNA，紫外分光光度計檢測DNA濃度及純度。

1.2.2 PCR擴增：設(shè)計3對特異性引物（表1），用于擴增SULT4A1基因5’端（-804 bp～+167 bp）及含有rs2285162和rs963263位點的DNA片段。

擴增體系20 μL，內(nèi)含5 U/μLrTaq酶（日本TaKaRa公司）0.2 μL，10×Buffer 2 μL，dNTP 2 μL，5 pmol/μL上下游引物各1.5 μL，20 ng/μL DNA模板2 μL，滅菌去離子水10.8 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)30次。

表1 SULT4A1基因5’片段、rs2285162和rs963263位點擴增引物Tab.1 SULT4A1 gene 5’ fragment，rs2285162，and rs963263 amplification primers

SULT4A1基因5’端及rs963263位點的PCR擴增體系Buffer為2×GC Buffer Ⅱ，反應(yīng)條件中的延伸時間為72 ℃ 40 s和72 ℃ 20 s，其他條件相同。

1.2.3 擴增產(chǎn)物檢測：SULT4A15’端PCR擴增產(chǎn)物委托沈陽萊博睿生物科技開發(fā)有限公司進行測序分析，測序引物正向引物5’-TTTACCAATGTAAGCTC CAACAGGG-3’；反向引物5’-GACTTGGGGTAGGTG ACGATC-3’。測序結(jié)果利用Chromas2.23和DNAman 8.0軟件進行分析。rs2285162和rs963263位點以限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）方法進行分型。反應(yīng)體系為10 μL，1 U/ μL酶1 μL，Buffer 1 μL，PCR產(chǎn)物1 μL，滅菌去離子水7 μL，水浴1 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳時間分別為30 min和50 min，EB顯色后進行分型。rs2285162位點使用BstYⅠ酶，NEB Buffer2.1，60 ℃水?。籸s963263位點使用HhaⅠ酶，CutSmart Buffer，37 ℃水浴。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

根據(jù)測序以及RFLP分型結(jié)果計算基因型頻率和等位基因頻率，并通過Haploview4.2軟件進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗并進行連鎖不平衡分析。計算雜合度、個人識別力、非父排除率和PIC。用SPSS 22.0 軟件檢驗不同人群間等位基因分布差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4個位點的基因型分型

根據(jù)RFLP圖譜可以對rs2285162和rs963263位點進行正確分型（圖1、2）。根據(jù)DNA序列分析圖譜在SULT41基因5’端DNA片段中可對rs549267654進行分型，同時在-77～-72處發(fā)現(xiàn)了新的6 bp（TGCGGG）插入位點，已經(jīng)上傳至美國國家生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI），命名為ss2137544034（圖3）。

2.2 4個位點的遺傳多態(tài)性分布

圖1 rs2285162位點PCR產(chǎn)物酶切后電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis gel of rs2285162 PCR product after digestion

圖2 rs963263位點PCR產(chǎn)物酶切后電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis gel of rs963263 PCR product after digestion

rs549267654、rs2285162、rs963263和ss2137544034位點在中國北方漢族群體中均具有遺傳多態(tài)性。位點ss2137544034只檢測到2種純合型，并未檢測到雜合型。4個位點的等位基因見表2。因新發(fā)現(xiàn)位點ss2137544034不符合Hardy-Weinberg，所以不進行后續(xù)的分析。

圖3 ss2137544034和rs549267654位點序列分析圖譜Fig.3 Sequence map of ss2137544034 and rs549267654

2.3 3個位點的法醫(yī)學(xué)參數(shù)

根據(jù)SULT4A1基因3個位點在中國北方漢族群體中的遺傳多態(tài)性，計算各位點的法醫(yī)學(xué)參數(shù)（表3）。其中rs549267654、rs2285162和rs963263位點的個人識別率均超過0.6，非父排除率均接近0.2。

2.4 單倍型及連鎖關(guān)系分析

3個位點的連鎖分析結(jié)果顯示，rs549267654、rs2285162和rs963263位點可以組成8種單倍型，其中4種單倍型的頻率＞5%（表4）。組成單倍型后的個人識別率為0.843。

表2 4個位點在中國北方漢族群體中的多態(tài)性分布Tab.2 Polymorphism distribution of 4 loci in the Han population of northern China

表3 4個位點在中國北方漢族群體中的法醫(yī)學(xué)參數(shù)Tab.3 Forensic parameters of 4 loci in the Han population of northern China

表4 3個位點組成的單倍型及在中國北方漢族群體中的頻率Tab.4 The haplotypes consisting of 3 loci and their frequency in the Han population in northern China

3 討論

SNP可以彌補STR在嚴重降解檢材檢驗中不能提供遺傳信息的不足，但SNP作為遺傳標記應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實踐必須具有不同民族或地域的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。本研究檢測了中國北方漢族個體SULT4A1基因rs549267654、rs2285162、rs963263和 ss2137544034等4個位點，并提供了其多態(tài)性分布數(shù)據(jù)與相關(guān)的法醫(yī)學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，rs549267654、rs2285162和rs963263位點具有較好的遺傳多態(tài)性，個人識別幾率為0.619～0.649，非父排除率為0.177～0.187。其組成的單倍型的個人識別率為0.843。說明上述3個位點是較好的法醫(yī)學(xué)個人識別與親權(quán)鑒定備選的遺傳標記。

ss2137544034位點是本研究通過序列分析在SULT4A1基因5’端的-77 bp～-72 bp處新發(fā)現(xiàn)的，其形態(tài)為6個核苷酸（TGCGGG）的插入/缺失。本研究的樣品中，只檢測到了插入或缺失的純合型，未發(fā)現(xiàn)其雜合型，其個人識別率及非父排除率分別為0.434與0.17，具有較好的應(yīng)用意義。其多態(tài)性分布不符合Hardy-Weinberg 平衡（P＜ 0.05），經(jīng)結(jié)果核驗后不排除是位點突變所致。

本研究檢測的遺傳標記在國內(nèi)還沒有相關(guān)報道，將由NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）檢索到的SULT4A1基因rs549267654，rs2285162和rs963263位點在歐洲白人、非洲黑人、美國白人群體的多態(tài)性數(shù)據(jù)與本研究數(shù)據(jù)進行比較。中國北方漢族群體的等位基因頻率分布與黑人（非洲）和白人（美國、歐洲）人群的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，rs2285162與rs963263位點等位基因的頻率之比在黑人（非洲）中均約為0.9∶0.1，多態(tài)性程度較低，屬于低識別能力類遺傳標記。在人類遺傳學(xué)研究領(lǐng)域可能更有意義。

SULT4A1基因在人體內(nèi)高度保守［7］，其野生型蛋白僅在腦部神經(jīng)元中表達，隨著小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的成熟野生型蛋白表達增多［8］，說明SULT4A1對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有著重要作用。有研究［9］表明，在美國白種人群，SULT4A1基因5’UTR的多態(tài)性與精神分裂癥存在顯著的關(guān)聯(lián)性。深入探討SULT4A1基因的多態(tài)性位點與精神分裂癥之間的關(guān)聯(lián)，可能在法醫(yī)司法精神病鑒定的研究工作中具有一定意義。