宋相宇，李 鳴，王虎虎，徐幸蓮，蔡林林

（南京農業(yè)大學 江蘇高校肉類生產與加工質量安全控制協同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

白切雞又叫白斬雞，屬于中國傳統醬鹵肉制品的一種，具有“爽滑彈嫩”的食用品質，深受消費者喜愛。為了最大限度地保持雞肉的新鮮口感和風味，白切雞在加工過程中加熱溫度低、時間短，甚至很難達到巴氏殺菌的要求，因此白切雞成品極易腐敗變質[1]。包裝方式及貯藏溫度對白切雞中的微生物生長繁殖具有極大影響，因此，探明白切雞貯藏期間的菌群多樣性是控制細菌繁殖、延長貨架期的基礎。

目前絕大多數研究主要集中于包裝方式及貯藏溫度對生鮮肉中微生物菌群結構及貨架期的影響，結果表明不同氣調包裝方式結合低溫貯藏（0～4 ℃）能夠有效降低雞肉[2-3]、羊肉[4-5]、牛肉[6-7]中微生物菌落數，延長產品的貨架期。目前常用的菌相分析鑒定手段為微生物傳統培養(yǎng)以及聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）分子生物技術相結合的方法[8-9]，但是這些方法自身存在很大的局限性，比如自然狀態(tài)下環(huán)境中的大部分微生物都無法通過分離培養(yǎng)而得到，因此經過微生物傳統培養(yǎng)方式分析得到的微生物菌相信息單調、不全面，而PCR-DGGE技術雖然相對前者對菌株的鑒定速度更快，但依舊受到結果信息不全面的制約[10]。高通量測序技術不斷發(fā)展，以16S rDNA特定可變高通量測序最為典型，是近年研究菌群多樣性的新手段[11-12]。16S rDNA為編碼原核生物核糖體小亞基rRNA的DNA序列，具有10 個保守區(qū)域和9 個高變區(qū)域（V1～V9），其中保守區(qū)在細菌間差異不大，高變區(qū)具有屬或種的特異性[13]。對16S rDNA某個高變區(qū)進行測序，可用于食品微生物菌群結構多樣性的快速分析，已成功應用于豬肉[14]、雞肉[15-16]等生鮮肉品微生物菌群多樣性分析，而對于肉制品的研究較少。基于此，本實驗以傳統醬鹵肉制品白切雞為研究對象，結合Illumina Miseq高通量測序技術分析不同包裝及貯藏溫度下白切雞菌群結構及變化規(guī)律，為后期靶向抑制其腐敗及延長貨架期提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雪山草母雞整雞胴體（日齡115 d，凈質量約1 kg）購于常州立華大型肉雞屠宰公司。

DNA提取試劑盒 德國QIAGEN公司；DNA凝膠回收試劑盒 杭州AxyPrep公司；GelRed染料 美國Biotium公司。

1.2 儀器與設備

SMART500氣調包裝機 西班牙ULMA公司；H P P 2 6 0 恒溫恒濕箱、I C P 2 6 0 生化培養(yǎng)箱 德國Memmert公司；WH-2連續(xù)點動微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；J2-MI高速冷凍離心機、Microfuge 20R高速冷凍離心機 美國Beckmen公司；9700型PCR儀美國ABI公司；QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

白切雞制作工藝：原料生鮮雞→沸騰鹵水中浸提（3 次，2～3 s/次）→冰水沖洗→浸煮（95 ℃）→冰水冷浸→包裝→成品雞，將熟制后的白切雞樣品置于聚乙烯托盤中，采用空氣托盤（AP）、100% N2氣調（MN）和30% CO2+70% N2氣調（MC）3 種方式包裝，分別置于（4.0±0.1）℃（冷鮮溫度）、（12.0±0.1）℃（市場低溫貨柜實際溫度）下貯藏。取生鮮雞、新鮮白切雞（貯藏0 d）和各處理組在貯藏中期及末期時的樣品各3 盒測定相關指標，具體取樣時間及樣品編號見表1。

表 1 樣品處理方式及取樣時間Table 1 Sample processing methods and sampling times

1.3.2 菌體的收集

采用洗脫法[17]收集樣品中的微生物，并加以改進。在無菌環(huán)境中打開樣品，迅速放入裝有約200 mL生理鹽水（氯化鈉質量濃度0.85 g/100 mL）的均質袋中，密封后雙手充分揉捏約10 min使雞肉捏碎、雞骨揉斷。隨后將均質袋中的樣品-洗滌液混合物置于拍打式均質機中，選擇第2力度（6 次/s）拍打30 s，進行4 次，使樣品得到充分洗滌均質。樣品-洗滌液混合物經無菌濾紙簡單過濾后，將濾液倒入無菌離心管中，4 ℃、2 000 r/min離心5 min，取上清液于新離心管中在4 ℃下12 000 r/min離心5 min，去除上清液，將沉淀富集并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 總DNA的提取

采用DNA快速提取試劑盒按產品說明書進行對所有樣品進行DNA抽提，并用質量分數1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

1.3.4 PCR擴增及高通量測序

按指定測序區(qū)域（16S rDNA V3～V4區(qū)），合成帶有barcode的特異引物。每個樣本3 個重復，將同一樣本的PCR產物混合后用質量分數2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物。使用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統對PCR產物進行熒光定量，并進行相應比例的混合。構建Illumina PE250文庫后上機由上海靈恩生物科技有限公司進行高通量測序。

1.3.5 生物學信息分析

首先將利用Illumina PE250平臺測序得到的PE reads根據overlap關系進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾，區(qū)分樣本后進行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析和物種分類學分析，基于OTU可以進行物種多樣性指數分析，以及對測序深度的檢測；基于分類學信息，可以在各個分類水平上進行群落結構的統計分析。

1.4 數據處理與分析

所有實驗重復4 次。所得數據用Excel軟件和SAS V8.02軟件進行統計。采用OriginPro 8軟件作圖，采用SPSS 9.0軟件對數據進行相關性分析，采用EZinfo 3.0軟件進行主坐標分析。

2 結果與分析

2.1 樣品Alpha多樣性分析結果

表 2 白切雞微生物菌群Alpha多樣性分析Table 2 Alpha diversity analysis of microbial flora in soft-boiled chicken

根據97%相似性水平下的OTU信息，采用Alpha多樣性指標的Chao1、Shannon及Simpson指數對樣品微生物物種豐富度和均勻度進行評估[18]。群落豐富度用Chao1指數描述，其值越高表明群落物種的豐富度越高，而Shannon指數和Simpson指數可以反映樣品的群落多樣性程度，Shannon指數越高、Simpson指數越低，表明群落物種的多樣性越高。由表2可以看出，所有樣品的OTU覆蓋率（Coverage指數）都達99.9%以上，說明本次實驗所建立的文庫可以比較真實、有效地反映樣本微生物的多樣性。從所有樣本測序結果抽取的OTU數量中，最多的為195，最少的為105，樣品包裝處理后得到的OTU數量較正常組樣本減少，說明包裝處理能有效降低樣本中的微生物種類。但所有樣本之間的細菌菌群多樣性較為相似，OTU數量相差不大。其中，正常組樣本Chao1指數均大于其他樣本，說明正常組樣本的菌群豐度最高，而4 ℃-AP-2樣本的豐度最低；正常組樣本Shannon指數高于其他樣本，且Simpson指數低于其他樣本，說明其菌群多樣性最高。Shannon-Wiener曲線[19]可以反映各樣本在不同測序數量時的微生物多樣性，當曲線趨向平坦時，說明測序數據量足夠大，可以反映樣品中絕大多數的微生物信息。本實驗所有樣本的曲線都隨著橫坐標的延長而逐漸穩(wěn)定，說明測序數據量合理，所含菌種數較多。

2.2 Beta多樣性分析結果

圖 1 白切雞微生物菌群NMDS分析圖Fig. 1 NMDS analysis of microbial flora in soft-boiled chicken

Beta多樣性主要分析了樣本與樣本間微生物群落組成的相似性[20]。非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析法是評估Beta多樣性的方式之一，它以點的形式將樣本包含的物種信息反映在多維空間上，通過點與點之間的距離體現樣本間的差異程度[21]。由圖1可以看出，每組內各個樣品點分布區(qū)域比較密集，樣品個體差異性較小，每組內3 個樣品微生物群落結構相似，平行性較好。4 ℃下貯藏，除MN-2處理組中3 個點所形成的圓形面積略大，其余各組所形成的圓形面積小，說明樣品平行性好。包裝方式與貯藏溫度變化時，各組圓圈交集較少，群落組成出現差距，此時不同處理發(fā)揮了作用，對白切雞菌群群落結構產生影響，使實驗組與對照組區(qū)分明顯。

2.3 物種組成分析結果

2.3.1 基于門分類水平的分析結果

經物種組成分析可得知一個或多個樣本在各分類水平上比對情況。采用統計學的分析方法，能觀測樣本在門、綱、目、科、屬的群落結構[18]。實驗共得到2 216 類OTU，且這些OTU都屬于細菌域，包括5 個門、40 個屬，本實驗重點分析了門和屬水平。

由圖2 可知，各組樣本生成的OT U 主要由4 個門構成：變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria），其中變形菌門和厚壁菌門在42 個樣品中占主導地位。鮮肉組和正常組兩種優(yōu)勢菌門分別占細菌總序列的88.50%和92.00%，4 ℃下AP組、MN組和MC組的占比（所有時間的平均值，下同）分別為99.85%、98.65%和96.70%，12 ℃下3 個處理組的占比更達到了99.9%，所有組別在兩個溫度下的變形菌門和厚壁菌門豐度之和平均占96.93%，說明包裝處理有效降低了白切雞中菌群的多樣性。此外，處理組樣本中嗜熱菌門（Thermophila）豐度極低，可能與貯藏溫度較低有關。

圖 2 白切雞微生物菌群門水平物種組成分析柱狀圖Fig. 2 Histogram obtained from microbial floral composition analysis of soft-boiled chicken at the phylum level

圖 3 白切雞微生物菌群屬水平物種組成分析柱狀圖Fig. 3 Histogram obtained from microbial floral composition analysis of soft-boiled chicken at the genus level

2.3.2 基于屬分類水平的分析結果

包裝方式及貯藏溫度對白切雞屬水平菌群組成的影響結果如圖3所示。為方便分析，選取豐度排名在前50的屬進行聚類，以便發(fā)現部分物種在不同樣品中的聚集信息。由圖4可知，假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、鏈球菌屬（Streptococcus）、嗜冷菌屬（Psychrophila）和乳桿菌屬（Lactobacillus）等為鮮肉組中相對豐度較高的菌屬。AP組貯藏末期，尤其是4 ℃-AP-2處理組，樣品中的菌相較為單調，假單胞菌屬成為絕對優(yōu)勢腐敗菌，其與環(huán)絲菌屬（Brochothrix）等共同抑制了其他非優(yōu)勢菌的生長。而含30% CO2的氣調包裝處理組在貯藏末期的菌相對較復雜，假單胞菌屬不再是絕對優(yōu)勢腐敗菌，造成CO2氣調包裝處理組樣品腐敗的主要優(yōu)勢菌屬包括環(huán)絲菌屬、沙雷菌屬（Serratia）和肉桿菌屬（Carnobacterium）等，同時嗜酸菌乳球菌屬（Lactococcus）和乳桿菌屬的相對豐度也比托盤包裝處理組更高。

圖 4 白切雞微生物菌群屬水平熱圖Fig. 4 Heatmap obtained from microbial floral composition analysis of soft-boiled chicken at the genus level

包裝方式及貯藏溫度會影響白切雞菌群屬水平上的組成。原料雞和新鮮白切雞兩個處理組中樣品的微生物種類及相對豐度比較相似。所有托盤包裝中樣品的假單胞菌屬都是相對豐度最大的菌屬，尤其在4 ℃下貯藏時，12 ℃下AP組較4 ℃不動桿菌屬相對豐度更高。在MN及MC氣調包裝中，微生物的相對豐度則明顯與AP處理組不同，假單胞菌屬不再是絕對的優(yōu)勢菌屬，尤其在MC處理組，假單胞菌屬的相對豐度在貯藏末期不足10%。此外，在MC及MN氣調包裝中，環(huán)絲菌屬及沙雷菌屬為主要的優(yōu)勢菌屬，12 ℃條件同4 ℃條件相比，前者中腸桿菌屬（Enterobacteriaceae）相對豐度約為15%，而后者中腸桿菌屬也是其低豐度優(yōu)勢菌群之一，12 ℃下MC及MN處理組中優(yōu)勢腐敗菌還包括克呂沃爾菌屬（Kluyvera），而4 ℃條件下該包裝樣品中的優(yōu)勢腐敗菌為肉桿菌屬，說明貯藏溫度同樣顯著影響著貯藏末期白切雞中的微生物組成。

2.4 物種主坐標分析結果

圖 5 不同包裝及貯藏條件下白切雞的微生物群落結構比較Fig. 5 Comparison of microbial community structures of soft-boiled chicken under different packaging and storage conditions

主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）是一種非約束性的數據降維分析方法，用來研究樣本群落組成的相似性或差異性[22]。圖中點的距離越近表示菌群結構越相似。由圖5可知，PC1為46.86%，PC2為32.46%，PC1與PC2的綜合差異能夠解釋全部結果的81.00%，可以用來解釋組間差異。從圖5可以看出，同一處理組不同平行的點比較聚集，說明樣品測序結果的重復性較好。鮮肉組及正常組無論是在PC1還是PC2上的投影都能夠同其他處理組顯著區(qū)分開。此外，不同包裝、不同貯藏溫度樣品在貯藏中期及末期所含物種的主成分逐漸分開，在不同象限聚集，說明不同處理組樣品的菌群結構隨著貯藏時間延長逐漸表現出差異。AP組的樣品在PC1上能同絕大多數氣調包裝的樣品顯著區(qū)分，并且在4 ℃貯藏中期及末期樣品重復的間聚集性很高，表明該兩組樣品中出現了優(yōu)勢菌群，并且抑制了其他菌的生長。MN和MC氣調包裝的樣品在不同溫度下貯藏中期及末期的菌種差異同樣主要體現在PC1上，但同一氣調包裝不同處理、不同階段間的物種變化趨勢無明顯規(guī)律。

3 討 論

微生物是影響白切雞品質和食用安全性的主要因素，而包裝方式和貯藏溫度對微生物的種類及數量有極大影響。因此，通過分析不同包裝及貯藏溫度下白切雞的菌群結構，從而為企業(yè)生產和消費者提供指導是非常有必要的。

不同處理組菌群之間差異較大，尤其在屬水平上。原料生鮮雞以及新鮮白切雞處理組中樣品的微生物種類和相對豐度比較相似，可見白切雞中的微生物主要來源于原料雞，并且加工工藝限制、原料雞清洗不完善等原因，使得白切雞所含微生物的種類十分繁雜[23]。12 ℃ AP組中不動桿菌屬豐度較4 ℃處理組高，不動桿菌屬是嚴格的需氧非發(fā)酵革蘭氏陰性球菌[24]，黏附性極強，是雞胴體天然攜帶的微生物。Carvalheira等[25]從超市購買的雞肉中提取出不動桿菌，并對其流行情況進行了研究，發(fā)現該菌并非嗜冷菌，因此可能在12 ℃下更有利于不動桿菌屬的生長。而在MN及MC氣調包裝中，假單胞菌屬不再是絕對的優(yōu)勢菌屬，尤其是MC處理組。假單胞菌是有氧貯存和氣調包裝冷鮮肉中常見的腐敗微生物[26-27]，其含有復雜豐富的酶系統比如蛋白分解酶和耐熱酶，所以其適應性和致腐能力較強，即使在低溫條件下也能生長繁殖。Andreani等[28]報道有氧環(huán)境和富含蛋白的食品能加速假單胞菌屬的生長繁殖，從而加速食品的腐敗，同時，在禽肉及加工肉制品中假單胞菌屬主要包括草莓假單胞菌（Pseudomonas fragi）、隆德假單胞菌（Pseudomonas lundensis）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）3 種，其中草莓假單胞菌從肉中分離出的比例最高，為56.7%～79.0%[29]。還有研究表明，無氧環(huán)境中較高的CO2濃度在8 ℃幾乎完全抑制熒光假單胞菌的生長[30]。因此，MC氣調包裝中，在缺氧和CO2抑菌作用的雙重作用下，假單胞菌屬的生長繁殖得到了很好的抑制。在MC氣調包裝中，環(huán)絲菌屬及沙雷菌屬為主要的優(yōu)勢菌屬，有研究報道，沙雷菌屬及環(huán)絲菌屬不論在有氧還是無氧條件下都能夠生長繁殖[31-33]，無氧包裝對其抑制效果不為明顯，其中熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）也是原料肉中主要的一種污染菌，具有很強分解蛋白和脂肪的能力[34]，在豬肉、牛肉、羊肉及腌制肉中均存在[35]。周富裕[36]研究表明，環(huán)絲菌屬是氣調包裝醬鹵肉制品中的主要腐敗菌之一，與本實驗結果相似。12 ℃下MC處理組中優(yōu)勢腐敗菌還包括腸桿菌屬和克呂沃爾菌屬，唐雪婷等[37]研究表明，低溫對接種的腸桿菌科生長有明顯的抑制作用。

4 ℃下MC氣調包裝末期處理組樣品腐敗的優(yōu)勢菌屬還包括肉桿菌屬，該菌屬能夠分解糖類產生乳酸，降低環(huán)境pH值，使得乳球菌屬和乳桿菌屬的相對豐度也較托盤包裝處理組更高。乳球菌屬和乳桿菌屬具有較強的耐酸能力[38]，大部分的乳球菌和乳桿菌在缺氧的環(huán)境下能夠生長繁殖，而在托盤包裝中可能會因受到其他菌群的制約無法大量繁殖，因此乳球菌屬和乳桿菌屬往往也會成為缺氧條件下禽肉制品的一種優(yōu)勢腐敗菌。

4 結 論

采用Illumina MiSeq高通量測序技術分析了包裝方式及貯藏溫度對白切雞中微生物菌群結構的影響，發(fā)現不同處理對樣品的微生物多樣性產生了較大影響。托盤包裝中，不論在12 ℃還是4 ℃下優(yōu)勢菌屬均為假單胞菌屬；MC處理組4 ℃貯藏末期優(yōu)勢菌屬包括肉桿菌屬，表明低溫貯藏的白切雞存在一定的致病風險；MC包裝在4 ℃下貯藏能夠有效減少白切雞微生物菌群的多樣性。