張忠鑫 鄒球龍 黎 琪 張曉琳 仉 磊*

（1.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，北京102209；2.北京市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全源頭控制工程技術(shù)研究中心，北京102209）

豆粕作為優(yōu)質(zhì)的植物性蛋白質(zhì)，是目前飼料工業(yè)應(yīng)用最廣泛的原料之一。豆粕的氨基酸組成較為合理，可滿足動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)需要，但存在抗?fàn)I養(yǎng)因子種類多、含量高的缺陷，使得其作為動(dòng)物飼料的消化利用率偏低，造成浪費(fèi)的同時(shí)也引起腹瀉等諸多的動(dòng)物疾病[1-4]。其中大豆球蛋白（Glycinin）和β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin）這兩種抗原蛋白致敏性最強(qiáng)，占大豆總蛋白的65%以上[4]。因此，如何降低飼料的抗原蛋白從而提升豆粕利用價(jià)值是飼料企業(yè)和養(yǎng)殖者亟需解決的問(wèn)題。

抗原蛋白可以通過(guò)微生物發(fā)酵及利用蛋白酶酶解進(jìn)行消除。實(shí)際生產(chǎn)中往往兩者同時(shí)進(jìn)行[5-12]。蛋白酶制劑主要根據(jù)其最適pH值分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶及堿性蛋白酶[13]。盡管豆粕的pH值在6.4～6.8的近中性范圍，但在微生物發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵豆粕的pH值逐漸降至4.5～5之間。另外在微生物發(fā)酵過(guò)程中的體系溫度也與酶制劑的最適溫度有差異。因此，選用適于微生物發(fā)酵條件的酸性蛋白酶及中性蛋白酶，并調(diào)節(jié)二者的劑量比例對(duì)提升發(fā)酵豆粕的抗?fàn)I養(yǎng)因子降解效率十分重要。本研究通過(guò)調(diào)研部分市售蛋白酶產(chǎn)品，檢測(cè)其在微生物發(fā)酵條件下對(duì)豆粕抗原蛋白的降解能力，為工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中挑選適合的發(fā)酵劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

46%豆粕購(gòu)自三河匯福糧油集團(tuán)飼料蛋白有限公司；MRS 培養(yǎng)基及LB 培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；大豆球蛋白定量測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，植物乳桿菌GJ25 及枯草芽孢桿菌BS01均為實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

通過(guò)市場(chǎng)調(diào)研，分別采購(gòu)12 種市售酸性及中性蛋白酶，廠家信息略。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 檢測(cè)酸性蛋白酶降解豆粕抗原蛋白

根據(jù)市售發(fā)酵豆粕產(chǎn)品的實(shí)際情況，在利用酸性蛋白酶降解抗原蛋白時(shí)，體系中添加2%的乳酸。即分別在200 ml 無(wú)菌水中加入稱取的0.2 g 酶制劑（50 000 U/g）及2 g 乳酸，混勻后加入到100 g 豆粕中，攪拌均勻后置于37 ℃恒溫24 h，酶解完成后按王寅等[14]報(bào)道的方法提取蛋白質(zhì)，選用12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，分析大豆球蛋白及β-伴大豆球蛋白的含量變化[14-16]。

1.2.2 檢測(cè)中性蛋白酶降解豆粕抗原蛋白

由于豆粕的pH值為6.5左右，因此無(wú)額外條件更改。即分別在200 ml無(wú)菌水中加入稱取的0.2 g酶制劑（50 000 U/g），混勻后加入到100 g 豆粕中，攪拌均勻后置于37 ℃恒溫24 h，發(fā)酵完成后提取蛋白質(zhì)[14]，選用12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，分析大豆球蛋白及β-伴大豆球蛋白的含量變化[14-16]。

1.2.3 蛋白酶解與微生物發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行的情況分析

接種GJ25乳酸菌種子于MRS 培養(yǎng)基，37 ℃過(guò)夜靜置培養(yǎng)，使其活菌數(shù)達(dá)到1×109CFU/ml 以上；接種BS01枯草芽孢桿菌種子于LB培養(yǎng)基，37 ℃過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，使其活菌數(shù)達(dá)到1×106CFU/ml以上。以上兩類菌液各取1 ml 加入到200 ml 無(wú)菌水中，按試驗(yàn)比例（酸性蛋白酶與中性蛋白酶的比例為10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10）稱取不同質(zhì)量的兩類蛋白酶并接入水中，保證兩種蛋白酶酶活總值為50 000 U/g，稱取混合酶制劑的質(zhì)量為0.4 g。充分混合后加入到100 g豆粕中，攪拌均勻后置于37 ℃恒溫48 h，發(fā)酵完成后提取蛋白質(zhì)[14]，選用12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，分析大豆球蛋白及β-伴大豆球蛋白的含量變化[14-16]，從而選出最優(yōu)酶制劑比例。

1.2.4 發(fā)酵時(shí)間的確定

按照所選擇的酶制劑比例重復(fù)進(jìn)行1.2.3節(jié)的試驗(yàn)，并在0、1、3、16、24、48、72 h取樣并提取蛋白質(zhì)[14]，進(jìn)行電泳檢測(cè)并利用膠圖分析軟件UVP-VisionWorks對(duì)電泳結(jié)果中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的條帶進(jìn)行定量分析：將未經(jīng)處理的豆粕對(duì)照樣品中的對(duì)應(yīng)條帶設(shè)定為100%，計(jì)算其他各試驗(yàn)組相關(guān)條帶的相對(duì)含量，從而挑選出最合適的發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)。

1.2.5 乳酸含量測(cè)定

取10 g 樣品，加入100 ml 煮沸過(guò)的去離子水，振蕩溶解10～20 min，取樣離心取上清，利用生物傳感分析儀（型號(hào)SBA-40E，山東省科學(xué)院生物研究所）測(cè)定乳酸含量并換算樣品中乳酸含量。

1.2.6 大豆球蛋白含量測(cè)定

利用大豆球蛋白定量測(cè)定試劑盒（北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司）進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 粗蛋白含量測(cè)定依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中粗蛋白的測(cè)定，凱氏定氮法》（GB/T 6432—2018）進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 酸溶蛋白含量測(cè)定

按照常磊等[11]報(bào)道的方法進(jìn)行測(cè)定。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同酸性蛋白酶對(duì)豆粕中抗原蛋白降解效果的比較

利用不同酸性蛋白酶對(duì)豆粕進(jìn)行處理，通過(guò)對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)各酸性蛋白酶對(duì)豆粕中兩類抗原蛋白的降解效果，結(jié)果如圖1所示，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定條件下(試驗(yàn)方法1.2.1)，各酸性蛋白酶酶制劑對(duì)豆粕的抗原蛋白降解程度具有差異，5號(hào)酸性蛋白酶在此條件下對(duì)抗原蛋白降解效率較高，其工作濃度為0.2%(m/m)。

圖1 不同酸性蛋白酶制劑對(duì)豆粕抗原蛋白的降解效果

2.2 不同中性蛋白酶對(duì)豆粕中抗原蛋白降解效果的比較

利用不同中性蛋白酶對(duì)豆粕進(jìn)行處理，通過(guò)對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)各中性蛋白酶對(duì)豆粕中兩類抗原蛋白的降解效果，結(jié)果如圖2所示，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定條件下(試驗(yàn)方法1.2.2)，各中性蛋白酶酶制劑對(duì)豆粕的抗原蛋白降解程度具有差異，5號(hào)中性蛋白酶在此條件下對(duì)抗原蛋白降解效率較高，其工作濃度為0.2%(m/m)。

2.3 不同蛋白酶配比劑量對(duì)豆粕抗原蛋白降解程度的比較

將上文挑選出的兩種蛋白酶按照如圖3 所示的質(zhì)量比例進(jìn)行混合，在微生物存在條件下（試驗(yàn)方法1.2.3，GJ25 及BS01 在達(dá)到菌液濃度要求后,每100 g豆粕添加1 ml菌液）發(fā)酵48 h后提取蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3。

圖2 不同中性蛋白酶制劑對(duì)豆粕抗原蛋白的降解效果

圖3 兩類蛋白酶不同比例條件下的菌酶協(xié)同效果

通過(guò)膠圖分析軟件UVP-VisionWorks對(duì)圖3(a)中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的條帶進(jìn)行定量分析，并將未經(jīng)處理的豆粕對(duì)照樣品中的對(duì)應(yīng)條帶設(shè)定為100%，計(jì)算其他各試驗(yàn)組相關(guān)條帶的相對(duì)含量，得到圖3(b)的結(jié)果。結(jié)果顯示，酸性蛋白酶與中性蛋白酶的混合作用可降解豆粕中大于60%的兩類抗?fàn)I養(yǎng)因子。其中，酸性蛋白酶與中性蛋白酶的比例在1∶1至1∶5內(nèi)降解效果達(dá)到最優(yōu)，最終確定比例為1∶1時(shí)較為合理，兩者工作濃度均為0.2%。

2.4 發(fā)酵時(shí)間的確定

利用5 號(hào)酸性蛋白酶與5 號(hào)中性蛋白酶1∶1 配比的酶制劑，在微生物存在條件下（試驗(yàn)方法1.2.4）對(duì)豆粕進(jìn)行處理，在72 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)采集樣品并進(jìn)行對(duì)應(yīng)的電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)豆粕發(fā)酵效果的影響

圖4可見(jiàn)，豆粕中兩種抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解效果隨時(shí)間增長(zhǎng)而提高，在48 h時(shí)達(dá)到最高，與72 h發(fā)酵效果無(wú)明顯差異，因此選定利用上文所述兩種酶制劑1∶1配比的菌酶協(xié)同發(fā)酵時(shí)間為48 h。

2.5 發(fā)酵效果評(píng)價(jià)

依據(jù)上述結(jié)果，參考本試驗(yàn)所用條件（試驗(yàn)方法1.2.3 及1.2.4）最終確定了發(fā)酵條件為：5 號(hào)酸性蛋白酶0.2%，5號(hào)中性蛋白酶0.2%，1%（v/m）枯草芽孢桿菌BS01（菌液濃度為1×106CFU/ml），1%（v/m）植物乳桿菌GJ25（菌液濃度為1×109CFU/ml），發(fā)酵時(shí)間48 h。對(duì)在該條件下得到的發(fā)酵豆粕進(jìn)行部分指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果如表1所示。

表1結(jié)果表明，本文確定的發(fā)酵劑及發(fā)酵條件下，發(fā)酵豆粕的粗蛋白及其中酸溶蛋白含量較高，提示其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。大豆球蛋白含量較低，提示該產(chǎn)品對(duì)豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子降解效果較好。產(chǎn)品pH值較低，乳酸含量較高可幫助維持動(dòng)物腸道環(huán)境。另外，該產(chǎn)品還對(duì)水蘇糖和棉籽糖兩類抗?fàn)I養(yǎng)因子降解效果明顯。

表1 豆粕發(fā)酵前后指標(biāo)檢測(cè)（以干物質(zhì)88%計(jì)）

3 討論

發(fā)酵豆粕是解決豆粕在動(dòng)物飼喂過(guò)程中消化利用率低下的重要手段之一，生產(chǎn)發(fā)酵豆粕需要根據(jù)原料特點(diǎn)選擇適合的條件及發(fā)酵劑。目前發(fā)酵豆粕生產(chǎn)所采用的發(fā)酵劑包含酶制劑和微生物。其中針對(duì)蛋白質(zhì)降解起主要作用的是蛋白酶制劑[9-10]。目前市場(chǎng)上酶制劑種類繁多，但是大部分酶制劑的最適條件與實(shí)際生產(chǎn)條件存在差異。在對(duì)酶制劑進(jìn)行選擇的時(shí)候不能僅憑酶活力大小作為判斷依據(jù)，而應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注針對(duì)目標(biāo)底物的特異性效果。

本試驗(yàn)針對(duì)降解豆粕中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子大豆球蛋白及β-伴大豆球蛋白這一目的，從挑選在非最適條件下適于降解豆粕的酶制劑入手，通過(guò)調(diào)整菌劑及酶制劑的配比，實(shí)現(xiàn)了較小成本下生產(chǎn)具有較高品質(zhì)的發(fā)酵豆粕。依據(jù)蛋白酶制劑的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 23527—2009），固體蛋白酶產(chǎn)品的活力單位定義為：1 g固體酶粉，在一定溫度和pH值條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸，即為一個(gè)酶活力單位，以U/g 表示[13]。在發(fā)酵豆粕生產(chǎn)過(guò)程中，為保證益生菌的增殖及活性，其發(fā)酵過(guò)程中的溫度變化及pH 值變化很難保證蛋白酶處在其最適條件。因此酶制劑產(chǎn)品所標(biāo)示的酶制劑活力并不能反映出其對(duì)不同底物如豆粕中大豆蛋白的降解程度。本研究結(jié)果表明，不同來(lái)源的酶制劑在酪蛋白水解能力一致的條件下，針對(duì)特定原料豆粕的降解效果存在差異。同時(shí)中性蛋白酶對(duì)豆粕的降解起到更主要的作用，這一結(jié)果也同前人研究結(jié)果一致，綜合考慮成本因素和豆粕降解效果，本研究最終確定了上述酶制劑配比比例及發(fā)酵條件。需要說(shuō)明的是，由于是隨機(jī)盲選，酸性蛋白酶和中性蛋白酶的最優(yōu)組編號(hào)均為5號(hào)，但是兩者并不來(lái)自同一廠家。另外，本試驗(yàn)所用豆粕均為自然顆粒大小，沒(méi)有經(jīng)過(guò)粉碎處理，也沒(méi)有滅菌處理，這些條件也是考慮到目前大部分發(fā)酵豆粕生產(chǎn)廠家的實(shí)際情況，盡量簡(jiǎn)化發(fā)酵的條件控制，具體發(fā)酵條件在實(shí)際生產(chǎn)中也可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行微調(diào)。同時(shí)，本研究針對(duì)特定原料進(jìn)行酶制劑篩選的思路和方法，也為實(shí)際生產(chǎn)中如何選擇合適的發(fā)酵劑產(chǎn)品提供了新的參考方案。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)酶制劑及酶制劑配比進(jìn)行篩選，確定了菌酶協(xié)同發(fā)酵中一套最適的發(fā)酵條件，適合發(fā)酵豆粕生產(chǎn)。得到的發(fā)酵豆粕產(chǎn)品中，粗蛋白含量50.86%，酸溶蛋白14.76%，大豆球蛋白25.3 mg/g，pH 值4.5，乳酸含量2.76%，水蘇糖含量0.017%，棉籽糖含量0.082%。該產(chǎn)品抗?fàn)I養(yǎng)因子低、乳酸含量高，是有益動(dòng)物腸道健康的發(fā)酵豆粕產(chǎn)品，并能較大程度節(jié)約成本。