趙閃閃 周 璞 劉 碩 常 娟 王 平 尹清強* 劉超齊 朱 群

（1.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南鄭州450046；2.舞鋼市畜產品質量檢測中心，河南舞鋼462599；3.葉縣動物疫病預防控制中心，河南葉縣467200；4.河南德鄰生物制品有限公司，河南新鄉(xiāng)453000）

玉米是畜禽飼料中的主要原料之一，在畜禽飼料中所占比例非常高，通?？梢赃_到50%～70%[1]。玉米在生長、收獲、儲存和運輸過程中很容易發(fā)生霉變。據(jù)聯(lián)合國糧農組織（FAO）的統(tǒng)計，每年全世界范圍內大約有25%的農產品受到霉菌毒素的污染，造成數(shù)百億美元的經(jīng)濟損失。隨著我國災害氣候的頻頻發(fā)生，部分真菌毒素呈現(xiàn)污染加重的趨勢[2]。玉米霉變后會被霉菌代謝產物——霉菌毒素污染。目前已知的霉菌毒素有300多種，其中對人和動物危害相對嚴重的有黃曲霉毒素B1(AFB1)、嘔吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)[3]。AFB1 毒性最強、分布最廣、危害最大、致癌力最強[4-5]。

AFB1對家禽免疫系統(tǒng)造成嚴重破壞，導致T淋巴細胞亞群減少，降低小腸中細胞因子的mRNA表達[6]。豬攝食AFB1污染飼料會出現(xiàn)采食量減少、體重降低、肝和免疫功能受損，以及血清生化指標的改變[7]。研究表明，肝癌高發(fā)區(qū)的地理分布與該地區(qū)食物被AFB1 污染程度呈正相關[8]。霉菌毒素污染是一個全球性的問題，不僅造成嚴重的經(jīng)濟損失，而且還關系到動物生產和食品安全，直接影響人類和畜禽的健康。

研究發(fā)現(xiàn)，很多種微生物都能抑制黃曲霉的生長和霉菌毒素的產生，如乳酸菌、芽孢桿菌、假單胞菌、短小桿菌、地衣芽孢桿菌等[9]。據(jù)報道，F(xiàn)lavobacterium aurantiacum能顯著地降低液體培養(yǎng)基中黃曲霉毒素的含量[10]。朱新貴等[11]將枯草芽孢桿菌、乳酸菌和醋酸菌與黃曲霉毒素液體培養(yǎng)60 h后，3種微生物對AFB1 的降解率分別為89%、88%和81%。Swary 等[12]研究證實，酵母細胞壁對霉菌毒素有較高的吸附率。本研究旨在通過將有降解AFB1功能的有益微生物進行高效組合，研究其對霉變玉米中AFB1的降解能力，為提高受霉菌毒素污染玉米的飼用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

霉變玉米來自河南省某飼料廠，產朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、丁酸梭菌均由河南農業(yè)大學飼料生物技術實驗室保存。

1.2 微生物培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨15 g、酵母浸粉10 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 ml、K2HPO42 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸銨2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g，水1 000 ml，pH值為6.2～6.6。

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化鈉10 g，水1 000 ml，pH值為7.0～7.2。

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g、酵母浸粉10 g、葡萄糖20 g，水1 000 ml，pH值為7.0～7.2。

丁酸梭菌培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉3 g、牛肉膏10 g、葡萄糖5 g、氯化鈉5 g、乙酸鈉3 g、可溶性淀粉1 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.05 g，水1 000 ml，pH值為6.8。

上述培養(yǎng)基為固體時需再加入2%瓊脂，定容后在121 ℃、0.15 MPa條件下滅菌20 min，備用。

1.3 菌種的活化

將實驗室保存的枯草芽孢桿菌接種到LB 液體培養(yǎng)基中，放在37 ℃、180 r/min 的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h。產朊假絲酵母接種到YPD 培養(yǎng)基中，放在30 ℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h。干酪乳桿菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h。丁酸梭菌接種到丁酸梭菌液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h。菌種用平板涂布法測定活菌數(shù)后統(tǒng)一調整活菌數(shù)至1×109CFU/ml，菌種保存于4 ℃冰箱中備用。

1.4 響應面回歸試驗設計

用Design-Expert 8.0.5 軟件中的Central Composite Design進行4因素3水平的設計，將產朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、丁酸梭菌4個微生物菌種作為設計的4個因素，分別定義為X1、X2、X3、X44個變量。以4 個菌種分別加入霉變玉米后對應活菌數(shù)為1×104、1×105、1×106CFU/g 3種水平作為設計的三個編碼水平，并延伸了臂長（-r和+r）。試驗設計見表1。

1.5 復合微生物菌群對霉變玉米中AFB1 降解的操作流程

按表1組合共有27個處理組，每個處理組3個重復。發(fā)酵時稱取72 g粉碎的霉變玉米置于1 L的燒杯中，量取27 ml蒸餾水與1 ml復合菌液混合均勻，加入霉變玉米中攪拌均勻，分裝到自封袋中，封口機密封，在37 ℃條件下培養(yǎng)4 d。另設1個不接種菌的空白對照組（3個重復）。在第4 d，分別以重復單位稱取10 g玉米樣品，加入到盛有50 ml 70%甲醇的100 ml 三角瓶中，提取的AFB1用德國拜發(fā)試劑盒測定，操作步驟按照說明書進行。

1.6 復合微生物菌群的優(yōu)化

按Design-Expert 8.0.5軟件給出的試驗方案進行霉變玉米的生物降解，以復合微生物菌群對霉變玉米AFB1 的降解率作為設計的響應值Y，進行復合微生物菌群的優(yōu)化。對響應值進行多元回歸擬合分析，得出回歸方程：Y=β0+β1X1+β2X2+β3X3+β4X4+β12X1X2+β13X1X3+β14X1X4+β23X2X3+β24X2X4+β34X3X4+β11X12+β22X22+β33X32+β44X42+β123X1X2X3+β124X1X2X4+β134X1X3X4+β234X2X3X4+β122X12X2+β132X12X3+β142X1X4+β12#X1X22+β1234X1X2X3X4+β12*X12X22。

式中：Y——預測的毒素降解率（%）；

X1、X2、X3、X4——自變量，分別對應產朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、丁酸梭菌；

β0——截距；

β1、β2、β3、β4——線性系數(shù)；

β12、β13、β14、β23、β24、β34、β123、β124、β134、β234、β122、β132、β142、β12#、β1234、β12*——交叉系數(shù)；

β11、β22、β33、β44——平方系數(shù)。

對方程進行方差分析及擬合度檢驗，檢驗結果符合統(tǒng)計學要求后，點擊軟件Optimization 選項的Numerical優(yōu)化功能，把Y的響應值選取最大值，利用軟件優(yōu)化得到4種菌的最優(yōu)組合模式。

1.7 最優(yōu)菌群組合方式優(yōu)化與驗證

根據(jù)1.6節(jié)所得的回歸方程預測菌群最優(yōu)組合模式，按1.5 節(jié)霉變玉米中AFB1 降解流程進行驗證試驗，驗證試驗分為試驗組和對照組。分別計算出最優(yōu)菌群組合模式對霉變玉米中AFB1 的降解率，與預測得到的降解率進行比較，得出相對誤差。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003 軟件進行初步處理，用SPSS 20.0 軟件進行ANOVA 方差統(tǒng)計分析。響應面分析采用Design-Expert 8.0.5軟件進行方差分析和作圖。試驗結果用“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 不同益生菌組合對霉變玉米中AFB1的降解作用

由表2 可知，不同的益生菌組合對霉變玉米中AFB1的降解率不同，最大AFB1降解率組為第12組，達到了50.24%（P＜0.05），即產朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、丁酸梭菌的活菌數(shù)分別為1×106、1×106、1×104、1×106CFU/g。

2.2 響應面模型構建及方差分析

把不同微生物組合菌群組合模式對霉變玉米中AFB1 的降解率作為響應值，將試驗結果填入響應值列后，利用Design-Expert 8.0.5 軟件對模型進行多元四次回歸分析：可得出回歸方程：Y=38.82-0.14X1+4.62X2+0.86X3-0.86X4+2.84X1X2-1.17X1X3-0.20X1X4-0.74X2X3+3.83X2X4+0.58X3X4-0.24X12+0.54X22-2.46X32-2.05X42-6.02X1X2X3+4.66X1X2X4+0.58X1X3X4+1.15X2X3X4-1.38X12X2+3.45X12X3-2.44X12X4+1.01X1X22-4.93X1X2X3X4-2.54X12X22。對回歸方程進行方差分析，結果見表3，該回歸模型P＞0.05，決定系數(shù)R2=0.98，矯正后R2=0.86，表明該模型擬合度較好。

表2 不同益生菌組合對霉變玉米中AFB1的降解率（n=3）

表3 響應值回歸方程的方差分析

2.3 最優(yōu)組合優(yōu)化與驗證

利用Design-Expert 8.0.5 軟件分析，預測出霉變玉米中降解率最高的最優(yōu)益生菌組合水平與12組重疊，換算后接種到發(fā)霉玉米中的活菌數(shù)分別為1×106、1×106、1×104、1×106CFU/g。在此條件下，經(jīng)過第二次試驗驗證霉變玉米中AFB1 的降解率為59.18%，與第一次試驗結果很接近，說明通過該響應面模型能較好地預測出復合益生菌對霉變玉米中AFB1 的降解率。

3 討論

霉菌毒素的脫毒方法包括物理、化學和生物法。物理和化學方法由于存在較多的弊端，很少在生產中應用。生物脫毒法主要包括微生物降解和酶解兩種。微生物（乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌等）對霉菌毒素的解毒機理包括發(fā)生在菌體內的生化反應、代謝物（包括酶等）的分解作用以及菌體對毒素的吸附作用等[13]。微生物降解霉菌毒素，具有不改變飼料原料本身的營養(yǎng)價值和感官品質，無有害殘留和成本低廉的優(yōu)點，逐漸受到人們的廣泛關注[14]。Peltonen等[15]將乳酸菌和一定濃度AFB1 在37 ℃培養(yǎng)24 h 后測定AFB1 的含量，結果表明2 株Lactobacillus amylovorus和1 株Lactobacillus rhamnosus 可以降解50%以上的AFB1。Bluma 等[16]篩選出的多株芽孢桿菌，皆對黃曲霉以及寄生曲霉類的生長有不同程度的抑制作用。研究表明，與益生菌單獨培養(yǎng)對霉菌生長的抑制作用相比，益生菌組合對霉菌生長和霉菌毒素的產生具有更好的抑制效果，這可能與菌株的協(xié)同作用和培養(yǎng)過程中所產生的復雜產物有關[17]。據(jù)報道，當單一的枯草芽孢桿菌與霉變玉米液態(tài)共培養(yǎng)時，能較好地降解霉變玉米中的AFB1[18]。目前，關于復合益生菌固態(tài)發(fā)酵霉變玉米來降解AFB1 的報道不多，本研究獲得的益生菌組合，通過降解霉變玉米中的AFB1，可提高霉變玉米的飼用價值，對于飼料資源的開發(fā)利用、畜禽健康養(yǎng)殖及畜產品安全生產具有重要意義。

4 結論

通過響應面的回歸試驗設計，獲得了可降解霉變玉米中AFB1的產朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌和丁酸梭菌等益生菌的最佳組合，對霉變玉米中AFB1 的降解達到59.18%，對提高霉變飼料的飼用價值意義重大。