張仲義

（皖西學(xué)院電信學(xué)院 安徽六安 237012）

一、引言

石斛黃酒因其具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與保健功能備受人們的關(guān)注，主要是因?yàn)槭泄δ苄远嗵桥c微量元素[1]。為了提升石斛黃酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與質(zhì)量，廣大科研工作者一直致力于生產(chǎn)工藝方面的研究。曾麗萍等人通過正交試驗(yàn)方法優(yōu)化芽孢桿菌與釀酒酵母發(fā)酵石斛酒條件，研制出口感達(dá)到97.5分的石斛酒[2]。然而，酒精是反映黃酒發(fā)酵程度與質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。趙梅等人發(fā)現(xiàn)黃酒前后發(fā)酵期酒精的濃度與氨基酸、總糖具有明顯的線性關(guān)系[3]。因此，黃酒廠家一般會(huì)通過監(jiān)測(cè)黃酒的酒精濃度來判斷酒糟的發(fā)酵程度。Yu等人通過紅外光譜快速進(jìn)行測(cè)定黃酒中酒精濃度，并建立了酒精與黃酒品質(zhì)匹配的參數(shù)模型[4]。但是，由于紅外光譜檢測(cè)方法制樣比較復(fù)雜，容易受水吸收峰的干擾，無(wú)法滿足黃酒發(fā)酵過程快速檢測(cè)需求。

激光拉曼光譜是近些來用于復(fù)雜樣品無(wú)損分析的重要手段之一，能夠替代紅外光譜進(jìn)行水樣微量分析。劉文涵等人建立了白酒類乙醇檢測(cè)的激光拉曼光譜法，檢出限達(dá)到1.02%[5]。然而，對(duì)于黃酒類復(fù)雜產(chǎn)品的拉曼光譜檢測(cè)方法鮮有報(bào)導(dǎo)。本文通過以拉曼位移880cm-1（-CCO伸縮振動(dòng)）和1455cm-1（-CH2彎曲振動(dòng)）作為特征峰，建立了檢測(cè)乙醇溶液濃度的激光拉曼光譜指紋圖譜。同時(shí)，以不同發(fā)酵程度的石斛黃酒為研究對(duì)象進(jìn)行檢測(cè)與驗(yàn)證，為推動(dòng)速效監(jiān)控黃酒質(zhì)量技術(shù)提供重要的參考依據(jù)。

二、材料與方法

（一）儀器試劑。分析天平（BD61型，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；微量分析型超純水機(jī)（ULUP-I型，四川優(yōu)普超純科技有限公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)（SIGMA1-14型，德國(guó)Sigma公司）；不銹鋼發(fā)酵罐（HF-S型，北京霍爾斯生物科技有限公司）；激光拉曼光譜儀（LRS2/3型，天津港東科技發(fā)展股份有限公司）：激發(fā)光源532nm，40mW；光柵1200L/mm；狹縫寬度0-2mm；示值精度0.01mm；物鏡倍數(shù)為50倍。

無(wú)水乙醇（AR，≥99.7%）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；石斛及其它輔料購(gòu)于本地超市；實(shí)驗(yàn)所用水均為超純水。

（二）實(shí)驗(yàn)方法。

1.乙醇標(biāo)準(zhǔn)液的測(cè)定。準(zhǔn)確量取1、2、5、10、20mL乙醇，分別配置成濃度為1%、2%、5%、10%、20%乙醇溶液。分別移取各個(gè)濃度的乙醇溶液20μL，滴到拉曼光譜儀載玻片上，并使用激光拉曼光譜儀自帶的物鏡進(jìn)行觀察，對(duì)焦進(jìn)行光譜掃描測(cè)定。

2.石斛黃酒發(fā)酵試驗(yàn)。稱取適量糯米，淘洗干凈后冷水浸泡12h，瀝干蒸煮至熟，冷卻后準(zhǔn)確稱量1000g米飯移入發(fā)酵罐中，加入鐵皮石斛、活化后液態(tài)酵母、麥曲以及適量的水，混合均勻，控制溫度15-18℃，密封發(fā)酵20天。為了保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性設(shè)置3組平行試驗(yàn)。

3.樣品采集。根據(jù)黃酒釀造經(jīng)驗(yàn)，其主發(fā)酵時(shí)間主要在5-7天，后發(fā)酵時(shí)間主要指10-20天。因此，為了讓取樣點(diǎn)分布均勻同時(shí)不影響發(fā)酵質(zhì)量，樣品采集時(shí)間點(diǎn)分別設(shè)置為第2、5、7、15、20天。每組平行試驗(yàn)各采集1個(gè)樣，合計(jì)15個(gè)樣品。收集到的樣品在4000r/min下離心5min，取上清液過濾，滴到拉曼光譜儀載玻片上，并使用激光拉曼光譜儀自帶的物鏡進(jìn)行觀察，對(duì)焦進(jìn)行光譜掃描測(cè)定。

4.數(shù)據(jù)采集與處理。本文使用origin 8.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與作圖，并使用軟件數(shù)據(jù)分析模塊進(jìn)行均值化與標(biāo)準(zhǔn)差分析。

三、結(jié)果與討論

（一）不同濃度乙醇拉曼光譜。如圖1所示，分別為濃度1%、2%、5%、10%、20%乙醇溶液拉曼光譜圖。大部分特征峰主要集中在750cm-1-3000cm-1拉曼位移區(qū)域，其它區(qū)域拉曼峰主要是水溶劑背景的特征峰，例如拉曼位移3200cm-1附近的特征峰。其中拉曼位移880cm-1處最為明顯，主要是因?yàn)橐掖挤肿又械?CCO伸縮振動(dòng)。此外，乙醇的拉曼光譜特征峰還包括拉曼位移 1085cm-1、1455cm-1、2880cm-1以及2935cm-1處。盡管這些特征峰與前人研究的譜圖存在少許偏差，但基本保持在±2cm-1左右。其中，拉曼位移1085cm-1處為-CH3不對(duì)稱伸縮振動(dòng)；拉曼位移1455cm-1和2880cm-1處為-CH2-與-CH3不對(duì)稱變形（彎曲）振動(dòng)；拉曼位移2935cm-1處為-CH2-與-CH3不對(duì)稱伸縮振動(dòng)。

圖1 不同濃度乙醇溶液拉曼譜圖

（a-e乙醇濃度：1%、2%、5%、10%、20%）

此外，考慮到溶劑背景以及樣品其它干擾組分的存在，本文選擇峰強(qiáng)度最高的拉曼位移880cm-1處作為定量峰。隨著乙醇濃度不斷增大，定量特征峰強(qiáng)度呈線性增大，所以拉曼位移880cm-1處特征峰強(qiáng)度能夠用于測(cè)定乙醇的含量。如表1所示，為定量峰峰強(qiáng)度與乙醇濃度數(shù)據(jù)匯總，通過origin軟件方差分析計(jì)算，得到乙醇濃度與拉曼位移880cm-1處特征峰強(qiáng)度相關(guān)系數(shù)r2=0.9915，線性回歸方程：Y=59.731x+26.048。通過回歸方程計(jì)算，加標(biāo)后乙醇溶液回收率達(dá)到85.2%～108.6%。

表1 定量峰峰強(qiáng)度與乙醇濃度數(shù)據(jù)

（二）加標(biāo)樣品拉曼光譜。根據(jù)設(shè)定的取樣規(guī)則，分別在第2、5、7、15、20天取樣并使用激光拉曼光譜檢測(cè)。如圖2所示，充分體現(xiàn)了石斛黃酒發(fā)酵制備不同階段乙醇濃度與時(shí)間變化的關(guān)系。在發(fā)酵過程中，在活性酵母與麥曲的催化作用下，糯米、石斛等碳水化合物不斷的轉(zhuǎn)化為乙醇。其中第0～7天為主發(fā)酵期，乙醇的濃度急劇增加，在第7天乙醇含量達(dá)到95g/L；在第7～20天為次發(fā)酵期，乙醇轉(zhuǎn)化的速度逐漸下降，最終含量逐漸趨于恒定（大約為110g/L）。

同時(shí)，不同發(fā)酵時(shí)間樣品的拉曼光譜圖顯示，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加乙醇的拉曼光譜特征峰：拉曼位移880cm-1、1085cm-1、1455cm-1、2880cm-1以及 2935cm-1處的峰強(qiáng)度均逐漸增大，說明乙醇產(chǎn)量在不斷增加。在主發(fā)酵期，拉曼位移1000cm-1-2000cm-1處存在較多干擾峰，可能由于主發(fā)酵過程中多糖、有機(jī)酸、淀粉等成分的影響導(dǎo)致出現(xiàn)峰強(qiáng)較弱的雜亂峰。但拉曼位移880cm-1處特征峰依然比較突出，不影響乙醇濃度的檢測(cè)。而在次發(fā)酵期，第10天與第20天的拉曼光譜譜圖中的特征峰型與數(shù)量基本一致，說明第10天基料碳水化合物以及基本全部轉(zhuǎn)化為乙醇，其他組分對(duì)于譜圖的干擾較小。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間樣品乙醇濃度變化

四、結(jié)論

隨著網(wǎng)絡(luò)科技的發(fā)展，促進(jìn)了石斛黃酒產(chǎn)業(yè)的迅速?gòu)?fù)蘇與突破地域的局限性，加快我國(guó)功能性飲品行業(yè)的改革速度。但黃酒產(chǎn)品質(zhì)量分析與監(jiān)控技術(shù)的研究依舊是目前的大熱點(diǎn)。為遏制市場(chǎng)上售賣虛假石斛黃酒的現(xiàn)象，提升黃酒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控檢測(cè)技術(shù)，本文通過激光拉曼光譜技術(shù)建立快速檢測(cè)石斛黃酒生產(chǎn)過程中乙醇濃度的方法。不僅具有分析速度快、準(zhǔn)確度高、回收率好等優(yōu)點(diǎn)，還實(shí)現(xiàn)了無(wú)損、綠色的乙醇濃度定性、定量檢測(cè)，對(duì)石斛黃酒實(shí)際生產(chǎn)過程質(zhì)量監(jiān)測(cè)具有良好的應(yīng)用價(jià)值。