王德望，龔金梅，彭麗紅，司明遠(yuǎn)，劉 夢(mèng)，歐陽(yáng)聰，張夢(mèng)迪

鈣化組織因含鈣鹽或磷酸鹽多、質(zhì)地硬，制片前需脫鈣處理，才能制出完整的骨組織或其他硬組織病理切片[1-2]。臨床工作中，組織脫鈣一般以骨組織為材料，通常在脫鈣前將所附軟組織剔除后(僅附少量軟組織)再進(jìn)行脫鈣處理。喉/下咽腫瘤的病變絕大部分起源黏膜病變，隨病情發(fā)展?jié)u累及外周組織及軟骨，因病理診斷的需要，需制作喉/下咽軟硬組織聯(lián)合切片。如何制作滿意的喉/下咽軟硬組織聯(lián)合切片，對(duì)于病理科是個(gè)技術(shù)挑戰(zhàn)。本科室從脫鈣液配制、組織分階段分切、脫鈣后殘留酸處理等幾個(gè)主要方面入手，進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)，對(duì)制作滿意的喉/下咽軟硬組織切片取得良好效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源收集2016年3月～2019年3月東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京同仁醫(yī)院耳鼻咽-頭頸外科手術(shù)切除的喉/下咽半切除或全切除標(biāo)本90余例。

1.2 主要設(shè)備切骨刀，全自動(dòng)組織脫水機(jī)，切片機(jī)，漂烘儀，染色機(jī)等。

1.3 試劑10%中性福爾馬林液，復(fù)合酸脫鈣液，85%乙醇溶液。

1.4 方法

1.4.1復(fù)合酸脫鈣液配制 甲酸330 mL，16%中性緩沖福爾馬林640 mL，鹽酸10 mL，冰醋酸20 mL。

1.4.2組織固定 標(biāo)本接收后，用常規(guī)10%的中性福爾馬林固定3 h以上，再用切骨刀將喉標(biāo)本沿縱軸將標(biāo)本粗切成非完全性離斷組織塊，用復(fù)合酸脫鈣液固定。注意事項(xiàng)：(1)組織未經(jīng)脫鈣不能直接用普通取材刀將組織切成薄塊，因軟組織與軟骨或骨化組織質(zhì)地不一，切時(shí)容易致軟硬組織分離，造成組織撕脫，只能用切骨刀將標(biāo)本切成粗塊。(2)標(biāo)本需常規(guī)固定一段時(shí)間后再行脫鈣，因?yàn)榻M織經(jīng)過(guò)固定后，可減緩酸對(duì)組織的損傷，如新鮮組織或組織未經(jīng)有效固定即行脫鈣處理，則可致紅細(xì)胞溶解，制片后易形成含鐵血黃素析出。

1.4.3分階段分切 待鈣化組織軟化，切感比軟組織質(zhì)地稍硬，但能將軟硬組織切成完整組織塊時(shí)，將軟硬組織切成0.3～0.5 cm厚組織片，再將組織塊另裝容器脫鈣24 h，以保證充分脫鈣。特殊標(biāo)本特別是用于科研的標(biāo)本，為力求組織的完整性、脫鈣充分，在粗切脫鈣軟化后，也可先切成厚的組織塊，根據(jù)實(shí)際需要充分脫鈣后再將其修整為常規(guī)0.3 cm的組織塊。分階段分切，梯度將組織薄層處理，有利于脫鈣完全(圖1)

1.4.4祛酸處理 組織脫鈣徹底后，需進(jìn)行祛酸，祛酸如不徹底，組織制片后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核染色不佳，嚴(yán)重者可使組織切片發(fā)灰，影響觀察和診斷[3]。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，組織徹底脫鈣后，第一天日間適當(dāng)流水沖洗，夜間再行85%乙醇溶液浸漬，第二天日間再繼續(xù)行流水沖冼，全過(guò)程約24 h，可保證后期達(dá)到滿意的制片效果。

1.4.5常規(guī)脫水、制片 喉/下咽切除標(biāo)本組織塊經(jīng)脫鈣祛酸后，隨其它組織常規(guī)進(jìn)行脫水、包埋制片。

2 結(jié)果

本組采用該方法處理的喉/下咽切除標(biāo)本，因沒(méi)有進(jìn)行軟骨的剔除，組織結(jié)構(gòu)完整，喉黏膜、韌帶、肌組織及伴或不伴骨化的軟骨一應(yīng)俱全，易于判斷腫瘤的侵犯層次。同時(shí)，由于組織分階段分切、脫鈣，其脫鈣徹底，組織完整，無(wú)脫鈣不完全制片后的組織空洞形成。組織祛酸徹底，HE染色色澤鮮艷，與常規(guī)非脫鈣組織無(wú)明顯區(qū)別(圖2～4)，而無(wú)脫鈣后祛酸處理不佳的組織切片發(fā)紅，核不著色的現(xiàn)象。

3 討論

喉/下咽管壁本身及外周均有較硬的鈣化組織或伴有不完全鈣化的軟骨組織，喉/下咽腫瘤大多來(lái)源于黏膜，起源于黏膜的惡性腫瘤隨病情發(fā)展逐漸向深層、外周組織(如甲狀軟骨)侵犯，侵犯層次越深，或累及外周組織越廣泛，則臨床分期越高，預(yù)后則越差[3-4]。因此，喉/下咽腫瘤標(biāo)本應(yīng)進(jìn)行脫鈣處理，觀察腫瘤對(duì)外周及軟骨的侵犯，嚴(yán)格進(jìn)行病理分期，為臨床醫(yī)師提供更多診斷信息以利于充分進(jìn)行預(yù)后評(píng)估。

①②③④

目前尚未有喉/下咽軟硬組織脫鈣處理的文獻(xiàn)報(bào)道，喉/下咽軟硬組織聯(lián)合脫鈣難度較高，可能主要受以下幾方面因素影響：(1)喉/下咽管壁及外周均有軟骨，但其硬化程度比真正的骨質(zhì)鈣化程度低，常用的骨標(biāo)本脫鈣液并不完全適用喉標(biāo)本脫鈣，因其濃度較高，易損傷組織。(2)喉/下咽軟硬組織的組織致密度、硬度不一，不能像骨組織一次性鋸成常規(guī)取材所需的0.3～0.5 cm組織塊。(3)現(xiàn)階段對(duì)于組織脫鈣后祛酸處理主要是對(duì)硬組織的研究，較少關(guān)注到軟硬組織整體脫鈣后，軟組織中易蓄積酸性脫鈣液。

本組復(fù)合酸脫鈣液以弱酸為主，配以低濃度的強(qiáng)酸為輔，并輔以穿透性強(qiáng)，且具有一定組織膨脹作用的冰乙酸，脫鈣效果比單純?nèi)跛崦撯}液快，對(duì)組織的損傷比單純強(qiáng)酸脫鈣液小[5]。喉/下咽軟硬組織制片不適合簡(jiǎn)便操作，強(qiáng)行一次性分切會(huì)導(dǎo)致軟硬組織相互分離，只有分階段分切，將組織梯度薄層處理，才有利于保持組織的完整性及脫鈣徹底。多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]經(jīng)弱酸脫鈣后的組織流水沖洗30 min即可，但我們發(fā)現(xiàn)喉軟硬組織脫鈣后一般需沖洗24 h效果較好，而30 min的沖冼時(shí)間過(guò)短會(huì)影響制片后的著色效果，可能大多數(shù)脫鈣研究的資料為分離軟組織后的骨組織，組織中含酸相比軟組織中含量較少有關(guān)。另外，筆者發(fā)現(xiàn)脫鈣后組織如沖洗不充分，直接進(jìn)入脫水程序，如脫鈣組織塊多、含酸量多的情況下，則會(huì)污染整批次的組織，導(dǎo)致染色效果差。根據(jù)脫水原理，我們認(rèn)為可能乙醇在脫水的過(guò)程中將組織內(nèi)的酸隨脫水而釋放出來(lái)。因此，我們?cè)诹魉疀_洗過(guò)程中特意設(shè)置一個(gè)重要環(huán)節(jié)，在組織脫鈣后流水沖洗祛酸的環(huán)節(jié)中增加乙醇溶液浸漬過(guò)程，該過(guò)程的改良可以使祛酸更徹底，同時(shí)比夜間流水沖冼更安全。

本組采用喉/下咽標(biāo)本的處理獲得較好的制片效果，有利于臨床病理診斷和腫瘤分期，但整個(gè)組織處理時(shí)間較長(zhǎng)，而使診斷周期偏長(zhǎng)。有研究表明脫鈣過(guò)程中聯(lián)合使用超聲波技術(shù)可加快分子運(yùn)動(dòng)[8-9]，預(yù)計(jì)可加速組織脫鈣及祛酸過(guò)程，從而縮短組織脫鈣處理過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)僅限于喉/下咽切除標(biāo)本的軟硬組織HE常規(guī)制片效果觀察，對(duì)其脫鈣祛酸后殘留酸的客觀判定以及軟硬組織聯(lián)合制片的免疫組化染色效果等未作深入分析，后期我們將進(jìn)一步深入探討，為病理制片提供參考。