王 鴻，周 晟，代 鵬

淋巴結(jié)組織纖維成分少，淋巴細胞豐富，往往還附有較多的脂肪組織，在制片過程中容易出現(xiàn)裂紋、細胞核皺縮、染色模糊甚至是脫片等，如需改善應(yīng)嚴格控制冷凍的溫度和時間，挑選滲透力強、固定作用強的固定液。本文通過對固定液配方的探索，著重與病理醫(yī)師交流制片的方法與經(jīng)驗，以提高淋巴結(jié)組織冷凍切片優(yōu)良率。

1 材料與方法

1.1 材料選取2019年1～3月我院手術(shù)室送檢淋巴結(jié)組織標本30例，其中乳腺前哨淋巴結(jié)12例，中央組淋巴結(jié)14例，其它淋巴結(jié)4例。所有組織均符合快速病理標本送檢要求。

1.2 試劑與器材德國Leica-CM1950恒溫冷凍切片機；進口OCT膠水；徠卡DB-80刀片；組織防脫玻片；常規(guī)HE染色試劑；中性樹膠；抗體CD3、CD20購自北京中杉金橋公司，二抗和DAB顯色液購自Dako公司；10%中性福爾馬林(成品)、95%乙醇、丙酮、甲醇、改良AAF固定液(15 mL 10%中性福爾馬林、40 mL丙酮、43 mL苦味酸飽和無水乙醇液、2 mL冰醋酸)；將它們分成10%中性福爾馬林組、乙醇組、丙酮組、甲醇組和AAF組。

1.3 方法用OCT膠水將組織環(huán)繞包埋覆蓋，置于-18 ℃冷凍臺中速凍約2 min，4 μm厚連續(xù)切片15張，快速放入不同固定液中固定2 min(除10%中性福爾馬林為室溫固定外，其它均為低溫固定，低溫固定可以避免溫度驟變引起的細胞變化)，每種固定液3張切片，1張行HE染色，另2張行CD3和CD20染色。HE染色流程為常規(guī)的冷凍切片HE染色。免疫組化染色流程：3%雙氧水封閉10 min，PBS沖洗3次，每張切片滴加100 μL一抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗，滴加100 μL二抗，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 結(jié)果判斷從本科室30名診斷醫(yī)師中隨機抽取2名醫(yī)師對5組切片染色結(jié)果進行雙盲法評分。HE切片根據(jù)組織結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)、細胞核(質(zhì))染色強度、核質(zhì)對比度進行評分。CD3、CD20免疫組化染色按組織結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)、陽性強度、陽性定位、背景染色進行評分。單項滿分為10分，最差為0分，5項檢查合計滿分為50分，若不能滿足臨床診斷則直接記為0分。

2 結(jié)果

2.1 HE染色經(jīng)10%中性福爾馬林固定的切片：鏡下組織結(jié)構(gòu)不清晰，細胞核皺縮，胞質(zhì)著色不良，核染色和胞質(zhì)染色對比度差(圖1)。經(jīng)95%乙醇固定的切片：鏡下可見較清晰的組織結(jié)構(gòu)，但細胞核存在收縮現(xiàn)象，細胞核染色模糊，細胞質(zhì)染色效果不佳，著色不鮮艷(圖2)。經(jīng)丙酮固定的切片：鏡下組織結(jié)構(gòu)較清晰，有核溶解現(xiàn)象，胞質(zhì)染色不佳，核染色和胞質(zhì)染色對比度尚可。經(jīng)甲醇固定的切片：鏡下組織結(jié)構(gòu)較完整、清晰，細胞核形態(tài)較完整，部分有核溶解現(xiàn)象，胞質(zhì)染色尚清晰，核染色和胞質(zhì)染色對比度較好(圖3)。經(jīng)改良AAF固定的切片：鏡下可以看到清晰的組織結(jié)構(gòu)，細胞核和細胞質(zhì)染色效果清晰，顏色鮮艷，兩者對比效果明顯(圖4)。

2.2 免疫表型經(jīng)10%中性福爾馬林固定的切片，CD3、CD20染色均出現(xiàn)不少的假陰性，影響臨床診斷(圖5)。經(jīng)95%乙醇固定的切片，組織結(jié)構(gòu)較清晰，染色陽性強度和定位較好，背景較清晰(圖6)。經(jīng)丙酮固定的切片，CD3、CD20均出現(xiàn)較多的非特異性染色。經(jīng)甲醇固定的切片，組織結(jié)構(gòu)完整清晰，陽性強度和定位較好，背景清晰(圖7)。經(jīng)改良AAF固定的切片，組織結(jié)構(gòu)完整清晰，陽性強度好，定位準確，背景清晰(圖8)。

2.3 評分在HE、CD3和CD20染色評分中，5組平均得分差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001)，平均得分AAF>甲醇>乙醇>丙酮>10%中性福爾馬林，進一步兩兩比較，福爾馬林組與其它4組平均得分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；乙醇組與丙酮組平均得分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(HE中P值為0.73；CD3中P值為0.96；CD20中P值為0.45)；AAF組與其它4組平均得分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001，表1)。

①②③④⑤⑥⑦⑧

表1 5組不同固定液固定切片染色評分

3 討論

冷凍切片是一種快速制片技術(shù)，在外科手術(shù)和病理科中較為常見，其將病理組織冷凍至一定硬度后再進行切片處理[1]。冷凍HE切片制作需時間短、質(zhì)量高，其診斷的準確性影響臨床手術(shù)方案的制定。但影響冷凍切片質(zhì)量的因素較多，其中一項最重要的因素是冷凍切片的固定，因此選擇合適的固定液對冷凍切片的HE染色質(zhì)量有十分重要的影響[2]。固定作用在于使蛋白變性、凝固、沉淀，保持細胞、組織原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，使水溶性物質(zhì)擴散，抑制酶的活性，保持細胞膜的完整性，防止切片模糊；同時，能使組織中各物質(zhì)沉淀和凝固后產(chǎn)生不同的折射率，使染色后的切片利于觀察[3]。

淋巴結(jié)組織在取材過程中往往會夾雜著較多的脂肪組織，應(yīng)與取材醫(yī)師有效溝通去除診斷無關(guān)的脂肪組織，原則上同一凍頭上不要超過3枚淋巴結(jié)組織，對于較大的淋巴結(jié)應(yīng)剖開取材[4]。淋巴結(jié)組織細胞密集，呈塊狀，細胞核染色深，冷凍切片中淋巴細胞易收縮，給診斷帶來一定難度。因此，決定了淋巴結(jié)組織在冷凍切片中對固定液選擇和染色過程中條件選擇的特殊性。

10%中性福爾馬林是HE染色中最常用的固定液之一，但其在冷凍切片中表現(xiàn)欠佳，可能與10%中性福爾馬林成分中含水量較多、無法低溫固定，造成了組織自溶，不適應(yīng)于對冷凍切片組織進行快速固定的樣本，而石蠟切片對組織緩慢滲透的固定效果良好，免疫組化標記CD3和CD20中均出現(xiàn)不少的假陰性，可能與未進行修復(fù)、抗原決定簇封閉有關(guān)。乙醇具備固定兼脫水功能，能夠?qū)⑶衅系乃秩コ?，從而使切片的組織結(jié)構(gòu)得以完好的保存下來，并且能夠使球蛋白、白蛋白、核蛋白完整沉淀，但是核蛋白的沉淀會在水中溶解，從而使著色效果不佳。除此之外，乙醇還會形成一層蛋白膜覆蓋在組織表面，使固定液和染液不能較好地滲入，從而對染色質(zhì)量產(chǎn)生不良影響[5]。丙酮為單純性固定劑，能使蛋白質(zhì)沉淀，滲透力強，在一部分組織中對核的固定欠佳，著色不良[6]，在本實驗中細胞核染色淡，收縮明顯，且更容易脫片，CD3和CD20染色均出現(xiàn)較多的非特異性染色。甲醇為沉淀類固定劑，對組織滲透性強，能迅速沉淀清蛋白、球蛋白和核蛋白，甲醇有著乙醇的收縮作用，收縮性比乙醇小[7]，對淋巴結(jié)組織的固定有較好的效果，但細胞核仍有收縮，核質(zhì)對比度還不夠鮮明。改良的AAF固定液是一種復(fù)合固定液，由無水乙醇、甲醛、丙酮、冰醋酸、苦味酸按一定比例混合，苦味酸能沉淀一切蛋白質(zhì)且對組織無明顯硬化作用，甲醛水溶液滲透力強，固定均勻，丙酮和冰醋酸均能使組織膨脹，聯(lián)合應(yīng)用既能抵消乙醇固定引起的組織高度收縮和硬化，又能加速固定，兼?zhèn)淇焖倜撍凸潭ㄗ饔?。本實驗中?jīng)改良AAF固定液制作的淋巴結(jié)切片組織結(jié)構(gòu)、細胞形態(tài)、胞質(zhì)對比度均優(yōu)于其它固定液。

綜上所述，改良的AAF固定液能夠顯著提高淋巴結(jié)組織冷凍切片的優(yōu)良率，配置簡單，值得臨床推廣。