陳繼發(fā)，曲湘勇

（1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西宜春 336000；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128）

腸道堿性磷酸酶（ALP）和二糖酶存在于小腸黏膜上皮細(xì)胞刷狀緣內(nèi)，其活性是評(píng)價(jià)腸上皮細(xì)胞發(fā)育和腸道功能的重要指標(biāo)[1]。黏蛋白是腸黏膜免疫系統(tǒng)中第一道防線——黏液層的主要成分，對(duì)腸黏膜屏障的完整性和免疫功能具有調(diào)節(jié)作用[2]?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis，BS）是一種應(yīng)用廣泛的飼用益生菌，BS 能提高乳鴿小腸二糖酶和ALP 活性[3]，上調(diào)肉仔雞空腸黏蛋白2（mucin-2）mRNA 表達(dá)量[4]，提示其能改善動(dòng)物腸道屏障，但關(guān)于BS 對(duì)蛋雞小腸刷狀緣酶活性和黏蛋白分泌影響的研究鮮有報(bào)道。蒙脫石（Smectite，SM）是一種層狀硅鋁酸鹽類黏土，可在腸道內(nèi)吸附有害菌、細(xì)菌毒素和霉菌毒素等，改善動(dòng)物腸道健康[5]。研究指出，SM 可提高斷奶仔豬空腸二糖酶活性[6]，有增加小腸杯狀細(xì)胞數(shù)量的趨勢[7]，但SM 是否能提高蛋雞腸道刷狀緣酶活性和黏蛋白表達(dá)尚不得知。體外試驗(yàn)表明，BS 和SM 在抑制有害菌、改善腸道屏障方面有協(xié)同作用[8]，推測二者聯(lián)用或許有利于維護(hù)蛋雞腸道屏障。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，添加5×108CFU/kg BS、0.5 g/kg SM 及二者聯(lián)用均提高了蛋雞產(chǎn)蛋性能[9]，推測與蛋雞機(jī)體養(yǎng)分代謝、腸道健康有一定關(guān)聯(lián)。因此，本試驗(yàn)旨在探討B(tài)S、SM 及其聯(lián)用對(duì)蛋雞血漿生化指標(biāo)、小腸刷狀緣酶活性和黏蛋白表達(dá)的影響，以期為二者在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 BS（可速必寧）購買于上海牧冠企業(yè)發(fā)展有限公司，BS 活菌數(shù)≥1×109CFU/g。SM（加利百靈-Z）由美國安牧然國際公司提供，其主要成分為鈣基SM>70%，無定形水合二氧化硅>15%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 本試驗(yàn)采用2×2 雙因子隨機(jī)設(shè)計(jì)，選擇29 周齡健康的羅曼粉殼蛋雞360 只，隨機(jī)分為4 個(gè)處理組，每個(gè)處理組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 只。對(duì)照組蛋雞飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組蛋雞分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加5×108CFU/kg BS、0.5 g/kg SM、5×108CFU/kg BS+0.5 g/kg SM 的試驗(yàn)飼糧。預(yù)試期1 周，正試期10周。預(yù)試期各處理組蛋雞均飼喂基礎(chǔ)飼糧，每日認(rèn)真觀察雞群，并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，使各處理組間蛋雞的采食量、蛋重和產(chǎn)蛋率差異不顯著。試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧參考《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 33-2004），并綜合考慮生產(chǎn)實(shí)際配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

蛋雞為3 層階梯式籠養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)3 只，各處理組的試驗(yàn)雞均勻分布在雞舍的上、中、下層。每日喂料2次（08:00 和15:00），上午、下午各撿蛋1 次。各組蛋雞飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同，正試期雞舍內(nèi)平均溫度、相對(duì)濕度分別為（25.55±2.78）℃、（77.23±6.25）%。蛋雞自由飲水，采用人工光照與自然光照相結(jié)合的光照方案，蛋雞每日光照時(shí)間為16 h。雞舍的衛(wèi)生清掃、消毒及糞便清理等常規(guī)工作按照雞場管理程序進(jìn)行。

1.3 樣品采集 試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)處理組隨機(jī)選擇12 只蛋雞（每個(gè)重復(fù)2 只）進(jìn)行采血，采血前12 h 停止喂料、自由飲水。參照文獻(xiàn)[9]的方法采集蛋雞血液和制備血漿，將血漿樣品保存于-20℃。另外，從每組隨機(jī)選取6 只雞（每個(gè)重復(fù)1 只），參照文獻(xiàn)[9]的方法采集蛋雞十二指腸和空腸黏膜樣品（每份采集1～2 g），將腸黏膜樣品凍存于-80℃，待測。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

1.4.1 血漿生化指標(biāo) 采用邁瑞B(yǎng)S-200 全自動(dòng)生化分析儀和邁瑞生物公司生產(chǎn)的配套試劑盒檢測蛋雞血漿中ALP、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性和總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、葡萄糖（GLU）、尿素氮（UN）、鈣（Ca）、磷（P）含量。

1.4.2 小腸黏膜刷狀緣酶活性 參照文獻(xiàn)[10]將十二指腸和空腸黏膜樣品用預(yù)冷的生理鹽水按1:9（w:v=g:mL）在冰浴條件下用手持勻漿機(jī)（T10BS25，IKA 公司，德國）制備成10%的組織勻漿，將勻漿液于4℃下3 500 r/min離心10 min，小心吸取上清液。使用酶標(biāo)儀（Multiskan GO，賽默飛世爾科技，美國）和南京建成生物工程研究所的試劑盒測定上清液中ALP、蔗糖酶、麥芽糖酶和乳糖酶活性。

1.4.3 小腸黏蛋白mRNA 表達(dá)水平 使用Trizol 法提取十二指腸和空腸黏膜總RNA，在RNA 濃度和質(zhì)量檢測合格后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)[9]。引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表2，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA 表達(dá)水平。

表2 引物序列信息

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 利用SAS 9.2 軟件中的一般線性模型程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行2×2 因子分析，分析主效應(yīng)BS、SM及二者的互作效應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果用平均值和集合標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05 表示差異顯著，0.05 ≤P<0.10 表示有變化的趨勢。

2 結(jié)果

2.1 BS、SM 及其聯(lián)用對(duì)蛋雞血漿生化指標(biāo)的影響 由表3 可知，主效應(yīng)分析表明，添加SM 降低了血漿ALT 活性（P<0.05），添加BS 對(duì)各血漿生化指標(biāo)均無顯著影響，SM 和BS 的互作效應(yīng)對(duì)GLU 含量有影響（P<0.05），對(duì)ALT、ALP 活性和ALB、Ca 含量有影響的趨勢。

2.2 BS、SM 及其聯(lián)用對(duì)蛋雞小腸刷狀緣酶活性的影響 由表4 可知，主效應(yīng)分析表明，添加BS 提高了蛋雞空腸蔗糖酶活性（P<0.05），對(duì)十二指腸麥芽糖酶活性有影響的趨勢；添加SM 提高了十二指腸乳糖酶活性（P<0.05），二者互作對(duì)所測定的小腸刷狀緣酶活性均無顯著影響（P>0.05）。

2.3 BS、SM 及其聯(lián)用對(duì)蛋雞小腸黏蛋白mRNA 表達(dá)水平的影響 由表5 可知，主效應(yīng)分析表明，添加BS 降低了蛋雞空腸黏膜mcuin-2mRNA 表達(dá)水平（P<0.05），SM 上調(diào)了空腸mcuin-5acmRNA 的表達(dá)量（P<0.05），BS 和SM 對(duì)空腸mucin-2mRNA 表達(dá)水平有交互作用趨勢。

3 討 論

3.1 BS、SM 及其聯(lián)用對(duì)蛋雞血漿生化指標(biāo)的影響 ALT、AST 和ALP 是反映肝臟健康狀況的主要指標(biāo)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧添加SM 顯著降低了蛋雞血漿ALT 活性，與前人的研究結(jié)果基本一致[11-12]，提示添加SM 可能利于維護(hù)蛋雞肝臟健康。據(jù)報(bào)道，SM 能在動(dòng)物腸道中吸附霉菌毒素、重金屬、有害菌及其毒素等，有利于維持腸道屏障功能，可降低細(xì)菌和毒素易位，進(jìn)而一定程度上減少肝臟損傷[10,13]。血液蛋白水平和UN 含量能夠反映機(jī)體蛋白質(zhì)的吸收利用情況，同時(shí)UN 也是評(píng)價(jià)腎功能的重要指標(biāo)；TG、TC 和GLU 含量分別反映家禽體內(nèi)脂質(zhì)、糖類代謝水平，血Ca 和P 則反映機(jī)體對(duì)Ca、P 的利用情況。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加SM 對(duì)血漿中上述指標(biāo)均無顯著影響，提示其可能不影響蛋雞機(jī)體養(yǎng)分代謝和腎臟功能，與Zhao 等[14]和王黎文等[15]的報(bào)道結(jié)果基本相符。

表3 BS、SM 及其聯(lián)用對(duì)蛋雞血漿生化指標(biāo)的影響

表4 BS、SM 及其聯(lián)用對(duì)蛋雞小腸黏膜刷狀緣酶活性的影響

表5 BS、SM 及其聯(lián)用對(duì)蛋雞小腸黏蛋白mRNA 表達(dá)水平的影響

本試驗(yàn)表明，BS 對(duì)所測定的血漿生化指標(biāo)均無顯著影響，提示BS 對(duì)蛋雞機(jī)體養(yǎng)分代謝和肝腎功能可能不產(chǎn)生影響。類似的，BS 不影響蛋雞血液中Ca、P、三?；视秃蚑C 含量[16]；而有研究指出，BS 顯著降低了蛋雞血液中TG、TC、UN 含量和AST、ALT 活性[17-18]。上述試驗(yàn)結(jié)果的差異可能跟蛋雞健康狀況、試驗(yàn)周期、養(yǎng)殖環(huán)境以及BS 來源、使用劑量等不同有關(guān)。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，BS 和SM 對(duì)血漿GLU 含量存在互作效應(yīng)，BS 和SM 聯(lián)用組GLU 含量較其他組均有降低，提示二者聯(lián)用可能一定程度上影響機(jī)體糖類代謝；動(dòng)物應(yīng)激時(shí)會(huì)使體內(nèi)儲(chǔ)存的糖原分解，并提高血漿GLU 濃度，這間接說明二者聯(lián)用可能有利于增強(qiáng)蛋雞抗應(yīng)激能力。BS 和SM 互作對(duì)血漿ALP、ALT 活性有影響的趨勢，二者聯(lián)用組這2 種酶的活性均低于其他組，說明SM 與BS 聯(lián)用后在一定程度上加強(qiáng)了對(duì)肝臟的保護(hù)作用，可能是由于二者聯(lián)用增強(qiáng)了腸道屏障功能，有效降低了有害菌及毒素易位[19]，進(jìn)而減少肝臟損傷。另外，二者互作對(duì)ALB和Ca 含量也有影響的趨勢，提示二者聯(lián)用后對(duì)機(jī)體蛋白質(zhì)和Ca 代謝可能產(chǎn)生一定影響。

3.2 BS、SM 及其聯(lián)用對(duì)蛋雞小腸刷狀緣酶活性的影響二糖酶活性的高低是評(píng)價(jià)腸上皮細(xì)胞發(fā)育程度和腸道功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)。研究表明，SM 可在一定程度上提高斷奶仔豬空腸二糖酶的活性[6]。本試驗(yàn)中，SM 著提高了蛋雞十二指腸乳糖酶活性，提示添加SM 可能有利于促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖，提高腸黏膜屏障功能。SM 提高小腸二糖酶活性的可能原因有兩方面：一方面，SM具有陽離子交換性，其晶層中含有的銅、鋅、Ca 等金屬離子在畜禽腸道中被置換出來，之后被機(jī)體吸收或者在消化過程中發(fā)揮激活相關(guān)酶的作用；另一方面，SM作為一種消化道黏膜保護(hù)劑，可覆蓋在腸道黏膜表面，有效減少霉菌毒素、有害菌及細(xì)菌毒素等造成腸上皮細(xì)胞的損傷，維持腸黏膜結(jié)構(gòu)的完整性和正常功能的發(fā)揮，從而利于二糖酶的分泌[10]。此外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BS 顯著提高了空腸蔗糖酶活性，與謝鵬等[3]的報(bào)道基本一致。完整的腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)有益于二糖酶的分泌，BS 可能通過降低腸道有害菌數(shù)量，改善腸道形態(tài)，進(jìn)而提高二糖酶活性[20]。腸道ALP 主要由腸上皮細(xì)胞分泌，若該酶活性降低，提示腸上皮細(xì)胞可能受損，腸絨毛萎縮，腸道功能下降[1]。本試驗(yàn)中，飼糧添加BS 和SM 對(duì)十二指腸、空腸黏膜ALP 活性均沒有顯著影響，說明BS 和SM 對(duì)蛋雞腸上皮細(xì)胞的正常發(fā)育以及腸道功能不會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。本研究中，BS 和SM 對(duì)小腸二糖酶、ALP 活性均沒有產(chǎn)生互作效應(yīng)，提示二者聯(lián)用可能不影響蛋雞小腸刷狀緣酶的分泌。

3.3 BS、SM 及其聯(lián)用對(duì)蛋雞小腸黏蛋白mRNA 表達(dá)水平的影響 黏蛋白是腸道免疫系統(tǒng)中第一道防線黏液層的主要成分，mucin-2和mucin-5ac是2 種重要的分泌型黏蛋白，對(duì)腸黏膜有直接保護(hù)作用[2]。本研究結(jié)果表明，SM 顯著上調(diào)了空腸mucin-5acmRNA 的表達(dá)量，提示SM 可能有利于促進(jìn)蛋雞腸道黏蛋白的分泌。腸道杯狀細(xì)胞數(shù)量是影響?zhàn)さ鞍追置诘闹饕蛩刂?，研究指出，飼糧添加SM 有提高斷奶仔豬小腸杯狀細(xì)胞數(shù)量的趨勢[7]。因此，推測SM 可能是通過影響腸道杯狀細(xì)胞的分泌來提高腸道黏蛋白的表達(dá)水平；也可能與其具有修復(fù)和保護(hù)腸道黏膜的作用有關(guān)。另外，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，BS對(duì)十二指腸mucin-2和mucin-5acmRNA 表達(dá)量沒有顯著影響，但對(duì)空腸這2 種黏蛋白的表達(dá)有負(fù)面作用。而Aliakbarpour 等[4]發(fā)現(xiàn)，BS 能顯著提高肉雞空腸mucin-2mRNA 表達(dá)量；也有研究指出，益生菌可能與腸上皮細(xì)胞中的特定受體位點(diǎn)結(jié)合并刺激黏蛋白的分泌[21]。鑒于前人發(fā)現(xiàn)益生菌對(duì)動(dòng)物腸道黏蛋白的表達(dá)具有促進(jìn)作用，本試驗(yàn)的結(jié)果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，BS 和SM 均可提高蛋雞小腸黏膜二糖酶活性；SM 還能上調(diào)空腸mucin-5acmRNA 表達(dá)量，降低血漿ALT 活性；二者聯(lián)用可能有利于改善蛋雞部分血液生化指標(biāo)。