程雋如，楊素芳，崔佳瑜，石德順，鄧彥飛

（廣西大學亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧 530004）

Sirtuins 是一類高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性酶，哺乳動物有7 個不同的Sirtuins（SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7），它們位于不同的細胞區(qū)室，具有多種催化活性。其中，SIRT6定位于細胞核，目前已知具有3 種酶活性，即NAD+依賴性組蛋白去乙?；竅1]、單ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶[2]和長鏈脂肪酸酯酶[3]，SIRT6通過數(shù)種催化功能在細胞及生物個體上參與多項生理活動。一方面，SIRT6基因是哺乳動物重要的長壽基因之一。Mostoslavsky 等[4]在缺乏SIRT6基因的小鼠中觀察到脊柱彎曲異常、皮下脂肪急性損失、淋巴細胞嚴重減少、代謝紊亂、壽命縮短等早衰癥狀，而SIRT6過表達可延長雄性（而非雌性）的壽命15%[5]。另一方面，SIRT6 通過維護端粒、促進DNA 雙鏈損傷修復和堿基切除修復維持基因的穩(wěn)定性[6]。同時，SIRT6 是能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，SIRT6 通過降低Hif1α的活性抑制糖酵解[7]，通過抑制肝臟糖異生減少葡萄糖的生成[8]、抑制甘油三酯的合成和脂肪酸的攝取、促進脂肪酸的β-氧化等代謝活動，從而維持代謝穩(wěn)態(tài)[9-10]。此外，SIRT6 還參與干細胞的重編程[11]、癌癥的發(fā)生和發(fā)展[12]、炎癥反應(yīng)[13]等生物活動。目前，研究人員正在確定靶向SIRT6 的治療劑，這些治療劑可能在衰老、癌癥、神經(jīng)退行性疾病，心臟病、肥胖癥和糖尿病[14-18]等多種人類疾病中具有廣泛的用途。

不僅如此，SIRT6 在畜牧業(yè)中也有應(yīng)用性研究。Gui 等[19]在秦川牛SIRT6基因外顯子區(qū)發(fā)現(xiàn)4 個SNP位點并證實SIRT6 多態(tài)性與個體的背膘厚度、肌內(nèi)脂肪含量和眼肌面積等胴體質(zhì)量性狀有關(guān)。Rincon 等[20]研究也表明SIRT6基因的多態(tài)性與育肥牛的胴體品質(zhì)和生長效率性狀有關(guān)。此外，SIRT6 啟動子區(qū)的SNP 位點與肉牛脂肪沉積有關(guān)[21]。這些研究表明SIRT6 在牛群標記輔助選擇以及改善肉質(zhì)方面至關(guān)重要。

目前，SIRT6 在人與小鼠上的研究較為廣泛，在家畜上研究較少，并且尚未有水牛SIRT6 相關(guān)研究報道，故水牛SIRT6基因?qū)毎δ艿难芯烤哂兄匾饬x。本研究以水牛胎兒成纖維細胞作為研究模型，構(gòu)建SIRT6基因RNA 干擾慢病毒載體，并鑒定轉(zhuǎn)染的有效性，為該基因在水牛上的研究與運用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、水牛胎兒成纖維細胞、293T 細胞、Psi-LVRU6GP 慢病毒質(zhì)粒、VSVG 包膜質(zhì)粒及NRF 包裝質(zhì)粒均為廣西大學亞熱帶農(nóng)業(yè)生物保護與利用國家重點實驗室保存。

1.2 主要試劑 Trizol 試劑購自Invitrogen 公司；PCR試劑金牌 Mix（green） Golden Star T6 Super PCR Mix購自北京擎科新業(yè)生物公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自北京天根化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR 定量試劑均購自諾唯贊公司；去內(nèi)毒質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA 公司；LB 培養(yǎng)基購自北京金橋科技公司；Taq 酶、內(nèi)切酶（EcoRI和BamHI）和T4 連接酶購自TaKaRa 公司；胎牛血清（FBS）、DMEM 細胞完全培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS 緩沖液、青鏈霉素等購自Gibco 公司；多聚賴氨酸（Poly-D-lysine）購自Sigma 公司；羅氏轉(zhuǎn)染試劑（X-tremeGENE HP DNA）購自Rhoce 公司；引物合成和序列測定在上海生工進行。

1.3 實驗方法

1.3.1 shRNA 的設(shè)計與合成 根據(jù)THEROMO FISHER 公司的siRNA 在線設(shè)計網(wǎng)站（http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/），針對本實驗室前期擴增出的水牛SIRT6基因的CDS（Coding Sequence）序列[22]篩選干擾序列，由于該網(wǎng)站沒有牛和水牛的基因庫，于是比對了人、鼠的基因庫，最后挑選出2 條保守性較好、分值較高的目標序列進行shRNA 設(shè)計，目標序列見表1。shRNA 序列設(shè)計原則：F 鏈5'→3'按照酶切位點（BamHI）、干擾序列、loop 環(huán)（TCAAGAG）、干擾序列的反向互補序列、中止信號（TTTTTT）、酶切位點（EcoRI）的順序；R 鏈5' →3' 按照酶切位點（EcoRI）、中止序列的互補序列（AAAAAA）、干擾序列、loop 環(huán)的反向互補序列（CTCTTGA）、干擾序列的反向互補序列、酶切位點（BamHI）的順序。

1.3.2 慢病毒干擾載體的構(gòu)建及驗證 將合成好的寡核苷酸單鏈經(jīng)退火后形成雙鏈shRNA，產(chǎn)物與Psi-LVRU6GP 載體分別用BamHI 和EcoRI 限制性內(nèi)切酶進行雙酶切反應(yīng)，分別回收酶切產(chǎn)物，利用T4 連接酶將回收的雙鏈shRNA 與線性化的Psi-LVRU6GP 載體進行連接反應(yīng)。連接體系：線性化的Psi-LVRU6GP 載體100 ng、雙鏈shRNA 500～1 000 ng、T4 DNA ligase1 μL、10×T4 DNA ligase Buffer 2 μL、50% PEG 4000 solution 2 μL，ddH2O 補至20 μL，混勻后置于16 ℃環(huán)境過夜。連接產(chǎn)物分別命名為Psi-sh1-LVRU6GP、Psi-sh2-LVRU6GP，設(shè)未連接干擾序列的空白質(zhì)粒為陰性對照（Negative Control，NC），命名為Psi-NC-LVRU6GP。連接完后進行轉(zhuǎn)化、挑菌，以菌液為模板進行PCR 鑒定、測序驗證，重組質(zhì)粒驗證成功后可進行去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取。

表1 水牛SIRT6 shRNA 干擾序列

1.3.3 慢病毒包裝 293T 細胞和水牛胎兒成纖維細胞37℃復蘇后，在37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，待細胞匯合度達60%～70%時轉(zhuǎn)染。取500 μL 無血清無抗生素的DMEM，目的質(zhì)粒與慢病毒包裝載體NRF、VSVG 按照質(zhì)量比5:3:2 混合，再加入轉(zhuǎn)染試劑X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent（目的質(zhì)?！棉D(zhuǎn)染試劑=1:1.5），混勻，室溫孵育15 min 后，逐滴加入293T細胞培養(yǎng)液中；12～24 h 內(nèi)更換新鮮的細胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染60 h 后收集細胞培養(yǎng)液，即病毒液，用0.45 μm 的濾器過濾、分裝后置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 慢病毒感染水牛成纖維細胞 將BFF 解凍復蘇后，傳至第4 代，待細胞匯合度為60% 左右時，每皿細胞分別加入1 mL 病毒液和2 mL 細胞培養(yǎng)液，再添加6 μg/mL Polybrene 促進感染。在第1 次病毒感染16～18 h 后棄細胞培養(yǎng)液進行第2 次感染，加入1 mL 病毒液和2 mL 細胞培養(yǎng)液重新感染至細胞匯合度至95%以上，觀察綠色熒光表達情況，并傳代進行后續(xù)實驗。每處理重復3 次，以未轉(zhuǎn)染外源基因的細胞為空白對照組，轉(zhuǎn)染Psi-LVRU6GP 空載體作為質(zhì)粒對照組。

1.3.5 水牛成纖維細胞SIRT6基因的mRNA 表達 用Trizol法分別提取2 個處理組與2 個對照組水牛成纖維細胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以β-actin為內(nèi)參基因，通過qRT-PCR 反應(yīng)檢測SIRT6基因的mRNA 表達量。反應(yīng)體系20 μL：上、下游引物各0.4 μL，模板（100 ng/μL）1 μL，2× chamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，三蒸水補至20 μL。反應(yīng)程序為95℃預變性5 min，95℃變性15 s、60℃退火50 s，變性、退火40 個循環(huán)。引物序列見表2。每個樣本重復3 次，采用2－△△CT方法計算目的基因的表達情況。

表2 引物序列

1.4 統(tǒng)計分析 熒光定量PCR 采用2－△△CT方法進行計算，每處理重復3 次；數(shù)值用SPSS Statistics 軟件單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析；以P<0.05 為差異顯著，具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒干擾載體的構(gòu)建及驗證 用限制性內(nèi)切酶BamHI 和EcoRI 雙酶切Psi-LVRU6GP 空白載體，回收線性化的載體。用T4 連接酶將shRNA 目的序列與線性化載體連接后，重組質(zhì)粒進行瓊脂糖凝膠電泳（圖1-A）及測序驗證（圖1-B），成功獲得Psi-sh1-LVRU6GP，Psi-sh2-LVRU6GP 2 個干擾載體。

圖1 Psi-shRNA 重組載體序列鑒定

2.2 慢病毒包裝 將Psi-sh1-LVRU6GP、Psi-sh2-LVRU6GP及Psi-NC-LVRU6GP 質(zhì)粒分別與NRF 和VSVG 共轉(zhuǎn)染293T 細胞，進行慢病毒包裝。轉(zhuǎn)染48 h 后，熒光顯微鏡觀察到明顯的綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）表達（圖2），轉(zhuǎn)染效率達70%以上，細胞狀態(tài)正常。

圖2 慢病毒包裝48 h 后GFP 表達（100

2.3 慢病毒感染水牛成纖維細胞 收集病毒懸×）液，分別感染第4 代水牛胎兒成纖維細胞，感染36 h 后，2 個shRNA 干擾組與質(zhì)粒對照組均可觀察到GFP 表達，而空白對照組無GFP 表達（圖3）。以上結(jié)果表明，所構(gòu)建的shRNA 干擾載體能成功轉(zhuǎn)入水牛胎兒成纖維細胞，并表達。

圖3 病毒液感染BFF 36h 后GFP 表達（100

2.4 水牛SIRT6基因shRNA 干擾效率的鑒定× ） 分別收集2 個shRNA 干擾組、質(zhì)粒對照組和空白對照組中BFF，通過qRT-PCR 檢測SIRT6表達水平來判斷shRNA 的干擾效率。如圖4 所示，干擾質(zhì)粒均能夠有效抑制BFF 細胞中SIRT6基因的表達，blank、Psi-NCLVRU6GP、Psi-sh1-LVRU6GP、Psi-sh2-LVRU6GP 表達量分別為1.00、0.86、0.34、0.06，2 個shRNA 干擾與質(zhì)粒對照組相比均差異顯著。其中Psi-sh2-LVRU6GP感染組SIRT6表達量最低，干擾效率最高。

3 討 論

圖4 慢病毒感染后SIRT6 表達差異

SIRT6 是一種復雜的酶，具有多種底物和催化活性，最主要的是NAD+依賴性組蛋白去乙酰化酶活性。目前已知的底物有組蛋白H3 第9 位賴氨酸殘基（H3K9）[23]、組蛋白H3 第56 位賴氨酸殘基（H3K56）[24]、組蛋白H3第18 位賴氨酸殘基（H3K18）[25]。Michishita 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，敲低人的胚胎肺成纖維細胞（WI-38）SIRT6基因之后H3K9 超乙?；?，H3K9 成為首個被發(fā)現(xiàn)的SIRT6 酶活底物。隨后有研究表明，H3K56 乙?；皆赟IRT6基因敲除的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）中顯著增加[24]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)細胞中SIRT6 的失活導致H3K18 過度乙?；彤惾旧|(zhì)周圍轉(zhuǎn)錄物的異常積累[25]。SIRT6對這些靶點的去乙?；饔脤τ谌旧|(zhì)壓縮、轉(zhuǎn)錄抑制和DNA 損傷修復非常重要[1]。此外，SIRT6 還具有其他酶促機制和底物，它參與DNA 修復和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的幾種非組蛋白去乙?；痆26]，促進某些DNA 修復和染色質(zhì)沉默因子的ADP-核糖基化[2]、催化長鏈脂肪酰基的脫酰作用[3]，參與調(diào)節(jié)多種細胞生物過程。

慢病毒載體是以人類免疫缺陷型病毒（HIV）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的新型基因載體，干擾載體包裝后感染目的細胞是目前基因沉默中較為直接高效的辦法。shRNA在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄為siRNA，siRNA 可以定位同源目的序列，與之結(jié)合并切割達到基因沉默目的，siRNA 具有放大效應(yīng)，因此只需要少許siRNA 便可高效沉默[27]。慢病毒感染不分細胞時期，相對逆轉(zhuǎn)錄病毒以及腺病毒具有制毒周期短、感染效率和外源基因整合效率高的優(yōu)點，是導入外源基因高效有力的方法[28]。

基于上述情況，本研究利用慢病毒載體干擾技術(shù)，設(shè)計2 條針對SIRT6基因的shRNA 干擾序列，構(gòu)建2 種抑制SIRT6基因表達的慢病毒載體，經(jīng)慢病毒包裝，感染細胞后通過實時定量PCR 在mRNA 水平上檢驗其轉(zhuǎn)染的有效性，篩選出干擾效率最優(yōu)的Psi-sh2-LVRU6GP 慢病毒載體。此外，本實驗的慢病毒載體攜帶 GFP，可以直觀地通過綠色熒光的數(shù)量和強度觀察轉(zhuǎn)染效率。病毒液感染細胞后可得抑制SIRT6基因表達的細胞株，為后續(xù)實驗中對比BFF 過表達SIRT6基因和正常表達SIRT6基因細胞株中基因穩(wěn)定性、細胞衰老、代謝功能等提供依據(jù)，也為該基因在水牛上的研究與運用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了2 種RNA 干擾SIRT6基因表達的慢病毒重組質(zhì)粒，經(jīng)慢病毒包裝感染水牛成纖維細胞后檢測SIRT6mRNA 表達水平，2 個干擾質(zhì)粒均能顯著下調(diào)SIRT6的表達，最終篩選出干擾效率最高的載體：Psi-sh2-LVRU6GP。為進一步研究SIRT6在BFF 細胞上的功能提供良好的手段和工具。