梁耀娣，陳 云，趙 坤，潘學(xué)情，張守全*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642；2.國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510642；3.廣東省農(nóng)業(yè)動(dòng)物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

頂體素結(jié)合蛋白（ACRBP）是頂體蛋白中的頂體素前體（proACR）和中間形式蛋白的特異性結(jié)合蛋白[1]，該蛋白特異性地定位于小鼠、豬、種馬和人的生殖細(xì)胞和精子細(xì)胞的頂體中[1-3]。研究表明，ACRBP 在精子發(fā)生和受精中起著不可缺少的作用，ACRBP 加工的改變或者異常會(huì)導(dǎo)致生育力下降、生育缺陷或者不育[4-6]。Kanemori 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，缺失ACRBP基因的雄性哺乳動(dòng)物精子細(xì)胞中的頂體結(jié)構(gòu)在精子發(fā)生后期嚴(yán)重變形，精子發(fā)生異常彎曲運(yùn)動(dòng)，雄性生育能力嚴(yán)重下降。ACRBP 在受精過程中能促進(jìn)精子的獲能和前頂體素蛋白成熟[7]，在頂體釋放和精卵結(jié)合中起著至關(guān)重要的作用[8]。Vilagran 等[9]實(shí)驗(yàn)證明可通過分析公豬精子中ACRBP 含量來預(yù)測(cè)其抗凍能力，ACRBP 含量較高的有較高抵抗凍融過程的能力。Pinar 等[10]對(duì)公豬精子樣本冷凍保存并解凍，發(fā)現(xiàn)精子活力下降，膜完整性變差，認(rèn)為在冷凍-解凍過程中ACRBP 受到了破壞。Kim 等[1]發(fā)現(xiàn)種馬在青春期前，通過免疫標(biāo)記法未檢測(cè)到生殖細(xì)胞中ACRBP 的存在，在青春期后的階段以及在粗線期之后的生殖細(xì)胞中都觀察到了ACRBP 的免疫標(biāo)記，因此認(rèn)為ACRBP 可用作種馬有性成熟的指示劑[1]。

為了進(jìn)一步研究豬ACRBP基因在豬的繁殖性能方面的影響作用，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建豬源的ACRBP真核表達(dá)載體及檢測(cè)豬精子精清及其他生殖器官中ACRBP的表達(dá)情況，為后續(xù)探究和揭示ACRBP 提高精子質(zhì)量和精子凍融后精子活力等繁殖性能的作用機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 質(zhì)粒pIRES2-EGFP、中國(guó)倉鼠癌細(xì)胞（CHO）均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑和試劑盒 2×TaqPlusMaster Mix、Phanta Max Super·Fidelity、2×Phanata Max Buffer、d NTP Mix（10 μmol/L）、10×DNA Loading Buffer、感受態(tài)細(xì)胞DH 5α均由Vazyme 公司提供；ACRBP引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成；Tris、Na2EDTA· 2H2O、冰乙酸、DL 2000 DNA Marker、DL 15000 DNA Marker、EcoRI和BamHI 限制性核酸內(nèi)切酶、10×K Buffer 緩沖液、T4 DNA 連接酶、緩沖液T4 DNA ligase Buffer 均由TaKaRa 公司提供；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA 小量提取試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑Atractene Transfection Reagent；RND 提取試劑盒均由TIANGE公司提供；凝膠DNA 微量回收試劑盒由Omega 公司提供；0.25% 胰酶-EDTA 溶液、二甲基亞砜（DMSO）由Sigma 公司提供；全蛋白提取試劑盒由凱基生物公司生產(chǎn)；100× 雙抗、PBS 溶液、DMEM（1640）液體培養(yǎng)基、FBS 由Gibco 公司提供：ACRBP抗體由Aviva Systems Biology 生產(chǎn)、鼠源β-actin 抗體由Affinity 公司生產(chǎn)、HRP Goat-Anti-Mouse IgG、HRP Goat-Anti-Rabbit IgG 由Vazyme 公司生產(chǎn)。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 在GenBank 獲取此ACRBP基因序列，并按照ACRBP基因序列在Prime5 軟件設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物和RT-PCR 引物，均由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成，其引物上游序列：5'-CGGAATTCTTA GAGGCCGCTCGGTCC-3'，下游序列：5'-CGGGATC CTGGGGTCCAACAGCAATGAA-3′。

1.4 豬睪丸組織RNA 提取與ACRBP擴(kuò)增及鑒定 采集豬睪丸組織，按照Total RNA Kit II （200）提取試劑盒說明書進(jìn)行RNA 提取后反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行濃度檢測(cè)。以睪丸cDNA 為模板進(jìn)行溫度梯度PCR 取最適退火溫度，隨后確定退火溫度，抽提重組載體，以pIRES2-EGFPACRBP重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)ACRBP基因。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，62℃退火15 s，72℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

1.5 pIRES2-EGFP-ACRBP真核表達(dá)載體構(gòu)建 通過瓊脂糖凝膠回收目的基因片段，并純化ACRBP基因PCR產(chǎn)物；用BamHI、EcoRI 分別對(duì)PCR 產(chǎn)物、pIRES2-EGFP 質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，使目的片段與pIRES2-EGFP 質(zhì)粒具有相同的粘性末端，反應(yīng)條件是單獨(dú)分開于37℃恒溫水浴3 h。反應(yīng)體系：1 μLEcoRI，1 μLBamHI，2 μL 10×K Buffer，1 μg cDNA/ 質(zhì)粒，加入dd H2O 至20 μL?；厥詹⒓兓?jīng)過酶切的目的基因和質(zhì)粒，進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系總共15 μL：0.8 μL T4 DNA ligase，1.5 μL 10 × T4 DNA ligase Buffer。反應(yīng)條件：16℃，16 h。次日，將連接產(chǎn)物全部加入DH5α感受態(tài)細(xì)菌中，并置于氨芐抗性平板上，先正置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 min，隨后倒置培養(yǎng)過夜，次日挑取單個(gè)菌落接種于含有氨芐抗性LB 培養(yǎng)液的離心管中，將離心管放在37℃、150 r/min 的搖床震蕩培養(yǎng)4 h，隨后吸取適量菌液進(jìn)行菌液PCR，將陽性管送至上海生工生物股份有限公司合成進(jìn)行測(cè)序。

1.6 pIRES2-EGFP-ACRBP重組載體轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞 將測(cè)序鑒定正確的含重組質(zhì)粒的菌液置于37℃，220 r/min搖床搖菌，待菌液渾濁，利用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒，進(jìn)行pIRES2-EGFP-ACRBP重組載體質(zhì)粒抽提。復(fù)蘇CHO 細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)。24孔鋪板時(shí)，細(xì)胞密度為1×105，加入含有10% FBS，不含抗生素的DMEM 1640 培養(yǎng)液，加入0.4 μg 用TE 緩沖液稀釋好的無血清培養(yǎng)基中，至總體積60 μL；加入1.5 μL 轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻，離心10 s；室溫下，孵育10～15 min；取出要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，棄孔中的培養(yǎng)液，用PBS 洗滌2 次，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液500 μL 每個(gè)孔；將包被體（60 μL+1.5 μL）加入孔中，輕輕搖到培養(yǎng)板混勻，放到37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～18 h，次日更換培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染24～48 h 后，在綠色熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光的表達(dá)情況。

1.7 細(xì)胞RNA 提取及合成cDNA 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株pIRES2-EGFP-ACRBP-CHO 由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建，分別收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-ACRBP-CHO 細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的單克隆細(xì)胞，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行RTPCR，用RNA 逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA 并檢測(cè)其濃度。其反應(yīng)體系共20 μL，首先進(jìn)行1 μL Oligo dTPrimer（50 μmol/L）or Random 6 mers（50 μL），1 μL Dntp Mixture（10 mmol/L），根據(jù)濃度算出1 μg RNA 體積，最后加入RNase Free dH2O 至10 μL，反應(yīng)條件及試劑使用根據(jù)試劑盒進(jìn)行。

1.8 Western blot 檢測(cè)ACRBP 蛋白的表達(dá) 提取公豬睪丸、附睪、前列腺、尿道球腺、精子、精清、性成熟母豬的卵巢和輸卵管，同時(shí)提取pIRES2-EGFP-ACRBPCHO 細(xì)胞的蛋白及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞蛋白進(jìn)行對(duì)比，以未轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞作為陰性對(duì)照。根據(jù)全蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白后，經(jīng)過SDS-PAGE 凝膠后轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上，5%脫脂奶封閉1 h，兔抗豬ACRBP 中4℃過夜孵育，羊抗兔二抗IgG 孵育1 h。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增目的基因最佳退火溫度結(jié)果圖 通過溫度梯度PCR 方法找到最適合的以公豬的cDNA 為模板的ACRBP退火溫度，在電泳結(jié)束后，在天能紫光分光儀中看到62℃中基因條帶最亮（圖1）。

圖1 豬源ACRBP 最適退火溫度

2.2ACRBP基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果圖 利用PCR 技術(shù)從豬睪丸組織DNA 擴(kuò)增出ACRBP基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1 813 bp 左右出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的特異性條帶（圖2）。

2.3 酶切重組質(zhì)粒結(jié)果圖 用EcoRI 和BamHI 雙酶切重組pIRES2-EGFP-ACRBP質(zhì)粒，產(chǎn)物經(jīng)過電泳得到酶切后的基因片段其片段長(zhǎng)度符合，條帶單一并且較亮（圖3）。

2.4 菌液PCR 檢測(cè)篩選陽性菌液結(jié)果圖 以經(jīng)過酶切、連接、轉(zhuǎn)化后得到的具有抗性基因的菌液為模板進(jìn)行PCR，篩選陽性克隆，將含有亮帶、符合長(zhǎng)度和條帶單一的菌液送到測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，圖中1、2、3、4 各取200 μL 進(jìn)行測(cè)序（圖4）。經(jīng)過上海生工生物股份有限公司，序列完全正確，結(jié)果證明ACRBP基因片段成功插入pIRES2-EGFP 表達(dá)載體中。

圖2 ACRBP 基因PCR 結(jié)果

圖3 EcoR I 和BamH I 雙酶切pIRES2-EGFP 質(zhì)粒電泳圖

圖4 菌液PCR 電泳圖

2.5 真核表達(dá)載體PCR 鑒定結(jié)果圖 將含有抗性的正確序列的菌液進(jìn)行培養(yǎng)后，與抽提質(zhì)粒后得到的重組載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切跑電泳、以抽提到的質(zhì)粒為模板，用ACRBP引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增跑電泳鑒定，雙酶切后得到ACRBP目的條帶及體質(zhì)粒條帶，PCR 擴(kuò)增得到ACRBP目的條帶，說明ACRBP基因成功導(dǎo)入pIRES2-EGFP質(zhì)粒中（圖5）。

圖5 pIRES2-EGFP-ACRBP 重組質(zhì)粒酶切回收PCR 產(chǎn)物（A）電泳圖和pIRES2-EGFP-ACRBP 重組質(zhì)粒PCR 產(chǎn)物（B）電泳圖

2.6 RT-PCR 陽性陰性對(duì)照結(jié)果圖 從經(jīng)過轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中提取出RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，經(jīng)過PCR 可以得到最純的ACRBP基因片段，將cDNA、重組載體質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的CHO 進(jìn)行RT-PCR 及電泳，結(jié)果顯示，cDNA 與質(zhì)粒均有目的條帶表現(xiàn)陽性，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的CHO 表現(xiàn)為陰性，可以判斷出ACRBP基因在癌細(xì)胞株中表達(dá)成功（圖6）。

圖6 RT-PCR 結(jié)果圖

2.7 熒光檢測(cè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞結(jié)果圖 抽提出來的pIRES2-EGFP-ACRBP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO 細(xì)胞中，通過培養(yǎng)，觀察熒光結(jié)果，初步認(rèn)定抗性基因成功導(dǎo)入表達(dá)載體（圖7）。

2.8 Western blot 檢測(cè)pIRES2-EGFP-ACRBP在CHO 細(xì)胞中表達(dá)結(jié)果 以沒有經(jīng)過轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體的CHO 細(xì)胞為對(duì)照組，檢測(cè)到轉(zhuǎn)染過重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-ACRBP的CHO 細(xì)胞中在32 ku 處有條帶，其大小與預(yù)期相符合，在未經(jīng)過轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照CHO 癌細(xì)胞在32 ku 大小處無條帶，說明ACRBP基因在蛋白水平上表達(dá)（圖8）。

圖7 轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞24 h 熒光結(jié)果

圖8 Western blot 檢測(cè)重組表達(dá)載體在CHO 中的表達(dá)結(jié)果

2.9 Western blot 檢測(cè)ACRBP基因在豬的精子精清中表達(dá)情況圖 從檢測(cè)結(jié)果中看到，ACRBP 在精子中檢測(cè)到有約32 ku 大小的條帶，而在精清中卻沒有檢測(cè)到（圖9）。

圖9 ACRBP 在精子精清中的表達(dá)結(jié)果圖

2.10 Western blot 檢測(cè)ACRBP在豬生殖器生殖器官中表達(dá)結(jié)果圖 公豬的睪丸、附睪尾、前列腺、尿道球腺、輸精管、性成熟母豬的卵巢和輸卵管在分子量約為60 ku處有條帶（圖10）。

圖10 Western blot 檢測(cè)ACRBP 在豬的生殖組織細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果圖

3 討 論

3.1 ACRBP 蛋白在公豬精子精清中表達(dá)情況 1989 年，Baba 等[3]從豬射出來的精子中提取分離純化出了32 ku的ACRBP，因此又稱它為sp32，并分離和鑒定了為sp32中間體的55、53、49 ku 大小形式的特異性結(jié)合蛋白。Baba 等[11]認(rèn)為sp32 最初是由1 個(gè)61 ku 前體蛋白和1個(gè)假定的信號(hào)肽在氨基末端合成的。也有研究者表明，哺乳動(dòng)物ACRBP 最初在生精細(xì)胞粗線期被合成為1 個(gè)約60 ku 前體蛋白（ACRBP-w），在精子發(fā)生過程中，通過去除前體ACRBP-w 的N 端產(chǎn)生大小為32 ku 的成熟形式ACRBP（ACRBP-c）[12]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到精子在32 ku 大小處有條帶，這與Baba 等[11]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，但與之對(duì)精液檢測(cè)不同的是本實(shí)驗(yàn)對(duì)精子精清進(jìn)行分離，并分開檢測(cè)精子精清中ACRBP 蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)精清中并沒有ACRBP 的表達(dá)，這為以后研究精子受精蛋白奠定了基礎(chǔ)。

3.2 ACRBP 蛋白在豬生殖器生殖器官中表達(dá)情況 Baba等[11]發(fā)現(xiàn)豬的sp32 及其前體的mRNA 僅僅在睪丸組織中有所表達(dá)，而在其他正常的組織不表達(dá)。后來研究表明精子蛋白sp32 廣泛地存在于各種正常組織中，表達(dá)量因組織不同而異，具有限制性表達(dá)于正常組織中，而其他異常組織的表達(dá)量也相對(duì)于正常組織高，選擇性地高表達(dá)于腫瘤組織的癌-睪丸抗原[13-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，豬的ACRBP 前體除了在公豬睪丸中有所表達(dá)，在豬的附睪尾、前列腺、尿道球腺、輸精管、性成熟母豬的卵巢、輸卵管中在蛋白水平上有表達(dá)。

3.3 pIRES2-EGFP-ACRBP真核表達(dá)載體成功構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)采用了在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中均能夠穩(wěn)定存在和自我復(fù)制，且具有多克隆位點(diǎn)和Neo 基因的pIRES2-EGFP 質(zhì)粒作為表達(dá)載體，連接構(gòu)建了pIRES2-EGFPACRBP真核表達(dá)載體、序列檢測(cè)、酶切重組質(zhì)粒檢測(cè)、熒光檢測(cè)、RT-PCR、Western blot 檢測(cè)，驗(yàn)證了所需要的目的基因片段正確克隆并插入了表達(dá)載體中，鑒定了陽性的pIRES2-EGFP-ACRBP重組質(zhì)粒表達(dá)的現(xiàn)象與理論符合。

4 結(jié) 論

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用真核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了豬源的重組ACRBP，并可得出ACRBP在豬的精子中有所表達(dá)，而在豬的精液中沒有表達(dá)，同時(shí)得出了ACRBP前體除了在公豬睪丸中有所表達(dá)，在豬的附睪尾、前列腺、尿道球腺、輸精管、性成熟母豬的卵巢、輸卵管中在蛋白水平上有表達(dá)。