孫 宏 ，張 恒,2，王 新，李園成，湯江武*，吳逸飛，姚曉紅，沈 琦，葛向陽

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院植物保護與微生物研究所，浙江杭州 310021；2.華中農(nóng)業(yè)大學生命科學與技術(shù)學院，湖北武漢 430030）

畜禽養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；?、集約化發(fā)展帶來了大量含有高濃度氨、磷污染物的養(yǎng)殖廢水，若處置不當將導致嚴重的環(huán)境問題，威脅人類健康。當前畜禽養(yǎng)殖廢水的脫氮技術(shù)主要以基于相關功能微生物的生化反應措施為主。其中，自養(yǎng)氨氧化菌在氮素循環(huán)中扮演了極其重要的角色，其主導的將氨氮（NH4+-N）轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛猁}氮（NO2–-N）過程為整個生物脫氮反應的關鍵限速步驟，而該步驟也是一種較為可行的處理NH4+-N 的措施[1-2]。目前，國內(nèi)外研究已在農(nóng)田土壤、污水處理廠、植物根際、人工濕地等來源相繼發(fā)現(xiàn)自養(yǎng)氨氧化菌的存在[3-4]。由于不同環(huán)境下的自養(yǎng)氨氧化菌的多樣性及生態(tài)活性均有顯著差異，因而篩選分離不同來源或針對不同處理水體的氨氧化菌仍具有顯著現(xiàn)實意義[5]。特別是當前畜禽養(yǎng)殖廢水由于NH4+-N 含量顯著高于普通污染水體，但目前有關從養(yǎng)殖廢水中篩選自養(yǎng)氨氧化菌的研究仍較少，對其處理效果也尚未明確。

本研究擬在采用變性梯度凝膠電泳技術(shù)（DGGE）監(jiān)控自養(yǎng)氨氧化功能菌群變化的基礎上，從處置畜禽養(yǎng)殖廢水的活性污泥中篩選自養(yǎng)氨氧化菌，并初步評價篩選獲得的菌株在養(yǎng)殖廢水中的實際去除效果，以期為處理養(yǎng)殖廢水、實現(xiàn)NH4+-N 的高效去除提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 活性污泥與富集培養(yǎng)基 本試驗所用活性污泥與養(yǎng)殖廢水均采自安吉吉成牧業(yè)有限公司養(yǎng)殖廢水綜合處理工程。其中，養(yǎng)殖廢水的NH4+-N、硝態(tài)氮（NO3–-N）、化學需氧量（COD）和pH 分別達到550 mg/L、25.4 mg/L、2190 mg/L 和7.8。

自養(yǎng)氨氧化菌富集培養(yǎng)基為基礎液和（NH4）2SO4溶液（10 g/L）按9:1 的體積比配制而成。基礎液為磷酸緩沖液100 mL、NaCl 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.03 g、CaCl20.136 g、NaHCO30.5 g、CuSO4·5H2O 母液（0.187 g/L）、EDTA-Na 母液（3.958 g/L）、MnCl2·4H2O 母液（0.114 g/L）、CoSO4·6H2O 母液（0.31 g/L）、Na2MoO4母液（0.08 g/L）各1 mL，加去離子水定容至1 000 mL 后滅菌。其中，磷酸緩沖液為K2HPO441.076 g、NaH2PO42.721 g，加水定容至1 000 mL。（NH4）2SO4溶液，單獨滅菌。

在液體富集培養(yǎng)基基礎上加入1.5%瓊脂粉并滅菌制備固體培養(yǎng)基。氨氧化富集培養(yǎng)基中的NH4+-N 濃度為212 mg/L。

1.2 自養(yǎng)氨氧化菌的富集培養(yǎng) 取100 mL 運行良好的液體活性污泥5 000 r/min 下離心5 min 去上清，用無菌生理鹽水洗滌2 次后，定容至100 mL，取樣50 mL于-20℃保存。剩余50 mL 污泥按照10%（v/v）的接種量接種至100 mL 自養(yǎng)氨氧化菌富集培養(yǎng)基中，于200 r/min、28℃下?lián)u床培養(yǎng)，每隔 2 d 取樣檢測NH4+-N、NO3–-N、NO2–-N 濃度和pH，采用1 mol/L 的NaOH調(diào)節(jié)pH 維持在7.5，當發(fā)現(xiàn)體系NH4+-N 耗盡時，補加NH4+-N 至200 mg/L，當NH4+-N 再次耗盡時，取樣50 mL 于-20℃下保存?zhèn)涮酓NA，并進行10%轉(zhuǎn)接到新的富集培養(yǎng)基中，重復上述富集轉(zhuǎn)接操作4 次。

對于保存的富集轉(zhuǎn)接樣品采用水相提取試劑盒（PowerWater DNA Isolation Kit，MOBIO）進行DNA提取，使用帶GC 夾子的amoA 基因引物（GC+amoA-1F：5 ' -C G C C G C G C G G C G G G C G G G G C G G G G G C G G G G T T TCTACTGGTGGT-3'；amoA-2R：5'-CCCCTCKGSAA AGCCTTCTTC -3'）[6]，按照文獻[7]的相應體系和擴增程序進行擴增后，放入4℃冰箱保存。amoA 基因的DGGE 電泳步驟參照張智超等[8]的報道進行，尿素變性梯度選用40%～60%，將amoA 基因PCR 產(chǎn)物取10 μL 上樣，在60℃、120 V 下跑膠10 h，EB 染色30 min 后拍照。切割明亮條帶用不帶GC 夾子的amoA 引物擴增，電泳驗證擴增成功后送交生工生物（上海）有限公司測序，用以評價富集培養(yǎng)的效果。

1.3 自養(yǎng)氨氧化菌的分離和鑒定 采用轉(zhuǎn)接4 次后的富集培養(yǎng)液進行梯度稀釋（10–2、10–3、10–4），涂氨氧化培養(yǎng)基平板培養(yǎng)7 d，挑取細小單菌落接種至含有20 mL 富集培養(yǎng)基的三角瓶中于200 r/min，30℃搖床培養(yǎng)3 d，使用Griess 試劑和二苯胺試劑檢測是否有NO2–-N 和NO3–-N 的生成[9]。取NO2–-N 顯色陽性而NO3–-N 顯色陰性的菌株，進一步在富集培養(yǎng)基中經(jīng)過3～5 次轉(zhuǎn)接純化培養(yǎng)，采用引物27F 和1492R 進行16S rDNA 測序鑒定[7]。測序結(jié)果遞交NCBI 數(shù)據(jù)庫進行Blast 程序?qū)Ρ?，采用MEGA 7.0 軟件選取同源性高的序列采用Neighbor-Joining 算法進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建[7]。同時，篩選的自養(yǎng)氨氧化菌送省農(nóng)科院檢測中心進行透射電鏡觀察。

1.4 篩選菌株的原位硝化能力評定 接種終濃度為104CFU/mL的自養(yǎng)氨氧化菌至含有200 mL 滅菌養(yǎng)殖廢水（5 倍稀釋）的500 mL 三角瓶中，以不接菌的滅菌稀釋廢水為對照，在30℃、200 r/min 下恒溫振蕩培養(yǎng)，每天取樣檢測NH4+-N、NO3–-N 和NO2–-N 的含量。每組試驗包含3 個重復，試驗周期為5 d。氨氧化速率計算：v=（pt-p0）?t，式中，v為t時間內(nèi)的NO2–-N 的生成速度，mg/（L·h）；p0為初始NO2–-N 濃度，mg/L；pt為培養(yǎng)t時間后對應NO2–-N 的濃度，mg/L；t為培養(yǎng)或處理時間[7]。

1.5 水質(zhì)檢測方法 NH4+-N 檢測方法采用《水質(zhì)氨氮的測定-水楊酸分光光度法》（GB 7481-87）；NO3–-N含量檢測采用《水質(zhì)硝酸鹽氮的測定-紫外分光光度法》（HZ-HJ-SZ-0138）；NO2–-N 的測定采用《水質(zhì)亞硝酸鹽氮的測定-分光光度法》（GB 7493-87）；COD檢測方法采用《水質(zhì)化學需氧量的測定-重鉻酸鹽法》（GB 11914-89）。

1.6 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)處理采用Excel 軟件進行，除菌株篩選結(jié)果外，均以平均值±標準差表示。顯著性分析采用SPSS 13.0 軟件進行t檢驗，P<0.05 代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 自養(yǎng)氨氧化細菌的富集培養(yǎng) DGGE 及條帶測序結(jié)果顯示（圖1、表1），自養(yǎng)氨氧化菌富集培養(yǎng)過程中，具有amoA 功能基因的微生物分布隨著培養(yǎng)轉(zhuǎn)接過程而發(fā)生變化。其中，條帶A～C 所對應的亞硝化菌的濃度逐漸減低，而條帶D 對應的亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonassp.）微生物的濃度在4 次富集后明顯增加，成為富集液中優(yōu)勢菌株。

圖1 自養(yǎng)氨氧化菌富集轉(zhuǎn)接過程的DGGE 指紋圖譜

表1 DGGE 條帶測序結(jié)果

2.2 自養(yǎng)氨氧化菌的篩選和鑒定 經(jīng)過富集培養(yǎng)后，從氨氧化平板上共挑到7 株菌落細小且為灰白或者乳白的菌落，分別命名為AH-1 至AH-7。接種到氨氧化菌富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取樣進行NO2–-N 和NO3–-N 顯色定性分析后發(fā)現(xiàn)，AH-7 的NO2–-N 顯色最為明顯，因而選擇AH-7 作為備用菌株進行鑒定。

AH-7 的電鏡結(jié)果顯示（圖2），菌株AH-7 呈卵圓形，直徑在0.5～0.75 μm，菌體細胞多呈兩兩聚集狀態(tài)分布。菌株AH-7 的氨氧化標志基因-amoA 基因跑膠鑒定呈陽性（圖3-B），其16S rDNA 擴增（圖3-A）并測序后，經(jīng)過Blast 對比，序列與亞硝化單胞菌（Nitrosomonas eutropha）（KU747123.1）的相似度最高，達到100%。挑選相似度高于98%的典型菌株進行多重序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)果菌株AH-7屬于亞硝化單胞菌（N.eutropha）。

圖2 菌株AH-7 在透射電鏡下的細胞形態(tài)（25 000×）

2.3 自養(yǎng)氨氧化菌AH-7 對滅菌養(yǎng)殖廢水中氮素含量的影響 由圖5 可知，在NH4+-N 為102 mg/L 的初始濃度下，經(jīng)過5 d 的培養(yǎng)，養(yǎng)殖廢水中NH4+-N 濃度降至7.56 mg/L，NH4+-N 降解率達到92.59%，顯著高于未接菌對照組。同時，隨著NH4+-N 含量降低，接入AH-7 的培養(yǎng)體系內(nèi)NO2–-N 可積累至87.24 mg/L（P<0.05），氨氧化速率達到16.87 mg/（L·d），顯著高于對照組。此外，培養(yǎng)前后NO3–-N 含量未見顯著變化。同時，接菌組和對照組相比，各時間點的NO3–-N 含量也均未見顯著差異。

圖3 菌株AH-7 的16S rDNA（1 500 bp，A）和amoA 基因（491 bp，B）的PCR 擴增電泳圖

圖4 菌株AH-7 的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

圖5 菌株AH-7 對滅菌養(yǎng)殖廢水中氮素含量的影響

3 討論

經(jīng)過自養(yǎng)硝化培養(yǎng)基的多次富集馴化，配合DGGE 對氨氧化amoA 功能基因的指示，本研究篩選獲得了1 株自養(yǎng)氨氧化菌AH-7，并鑒定為亞硝化單胞菌（N.eutropha）。前人研究證實，由于氨氧化菌自身生長緩慢，對環(huán)境變化又十分敏感，因而該類細菌的篩選難度較高[10-11]。同時由于培養(yǎng)周期長，而在培養(yǎng)基平板上菌落小，因此往往需要經(jīng)過多次富集并配合適當?shù)姆肿訖z測手段來提高篩選效率和準確性[12]。本研究所選用的amoA 基因是編碼氨氧化過程催化中關鍵催化酶-氨單加氧酶的基因，可直接用于指示自養(yǎng)氨氧化菌[13]。Abe 等[14]和Reddy等[15]采用熒光原位雜交技術(shù)對amoA 基因進行標記用以快速篩選獲得自養(yǎng)氨氧化菌的純培養(yǎng)。本實驗室前期已成功采用基于16S rDNA 為基礎的DGGE 技術(shù)輔助篩選NH4+-N 降解菌株[8]，而本研究中直接采用amoA功能基因進行跟蹤進一步提高了對目標微生物在富集過程中的指示作用，表明采用該技術(shù)可為篩選氨氧化菌提供幫助[16]。另一方面，本研究篩選到的亞硝化單胞菌屬于亞硝化單胞菌屬的自養(yǎng)氨氧化菌。該菌是目前已有報道中最為常見的氨氧化菌種，其在污水和富營養(yǎng)化地表水中分布廣、對氨氧化的貢獻也較大[17]。如魏偉偉等[18]曾報道在自然濕地底泥中富集分離到的氨氧化菌主要為亞硝化單胞菌屬。國外研究表明，氨氧化菌的生長條件差異較大，在不同環(huán)境營養(yǎng)水平下篩選的自養(yǎng)氨氧化菌有顯著差異[19]。Bollmann 等[16]研究表明，通過采用連續(xù)富集培養(yǎng)的手段，較易富集到亞硝化單胞菌屬的氨氧化菌，但對其他類別的氨氧化菌的分離效果較差。Otawa 等[20]對比了11 個污水處理廠中氨氧化菌含量后發(fā)現(xiàn)，在高NH4+-N 濃度（大于100 mg/L）下，亞硝化單胞菌（N.eutropha）占絕對優(yōu)勢；而在低NH4+-N濃度下，N.oligotropha菌的數(shù)量占優(yōu)勢。本研究中富集液濃度達到212 mg/L，因而富集后期以亞硝化單胞菌為主，符合上述研究結(jié)論。

本研究發(fā)現(xiàn)AH-7 在滅菌稀釋養(yǎng)殖廢水中培養(yǎng)5 d后的NH4+-N 降解率達到92.59%，顯著高于魏偉偉等[18]從自然濕地來源篩選的氨氧化菌的降解率（73.86%）和曾濤濤等[9]選用AOB 人工培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d 后所報道的最高73.1%的氨氧化能力。上述NH4+-N 降解差異可能與菌株不同和初始培養(yǎng)條件差異均有關。如魏偉偉等[18]研究中初始NH4+-N 濃度僅為5 mg/L 左右，與其相比，本研究中所用的NH4+-N 初始濃度高于100 mg/L，因而該菌株在該濃度下具有較好的降解能力。Shrestha等[21]報道自養(yǎng)氨氧化菌在濃度為40～50 mg/L 的初始NH4+-N 濃度下具有最佳的降解效率。張健等[22]從對蝦養(yǎng)殖底泥中篩選到一株氨氧化菌后研究表明，NH4+-N濃度在1～200 mg/L，氨氧化速率隨氨濃度的升高而加快；但當NH4+-N 濃度超過2 000 mg/L 后，氨氧化活性將會受到明顯抑制。但上述研究[22]在與本研究一致的初始NH4+-N 濃度（100 mg/L）下培養(yǎng)16 d 后，降解率僅為60.21%，顯著低于本試驗的報道，表明菌株AH-7 可能具有較好的應用開發(fā)前景。熊英等[23]研究證實單株亞硝化單胞菌在不同游離氨條件下具有不同的親和力，從而影響NH4+-N 轉(zhuǎn)化效率，并推測該差異可能與amoA 基因不同的拷貝數(shù)有關。同時，本研究中NH4+-N 的顯著降低伴隨著NO2–-N 含量的顯著提高，進一步表明系統(tǒng)內(nèi)主要發(fā)生了氨氧化代謝過程[24]。因此，通過投加篩選的AH-7 菌株，可增加體系的硝化效果，從而在畜禽廢水NH4+-N 去除上具有很大的應用價值。另一方面，有報道亞硝化單胞菌屬的微生物能在氧受限條件下，發(fā)生以NO2–-N 為受體的厭氧氨氧化反應，顯著提高生物脫氮效率[25]。于濛雨等[26]采用模擬系統(tǒng)固定化培養(yǎng)氨氧化菌后發(fā)現(xiàn)，氨氧化菌可實現(xiàn)短程硝化作用，氨氧化速率可高達50 mg/（L·d）。上述結(jié)果解釋了本研究中經(jīng)過培養(yǎng)后，滅菌養(yǎng)殖廢水中氮含量總體有所下降的情況，但有關AH-7 菌株是否有上述功能還需要進一步驗證。需要注意的是，與前人采用的方法不同[9,18]，本研究為了降低高濃度NH4+-N 對氨氧化菌生長的不利影響，同時兼顧后續(xù)在實際應用中與微藻的復配使用，對畜禽廢水做了稀釋處理用以評價AH-7 菌株的硝化效果。上述結(jié)果尚不能完整說明該菌在實際條件即未稀釋廢水中的應用效果。后續(xù)有關該菌的最高NH4+-N 耐受濃度的試驗正在開展，以完整揭示其在實際處理中的應用前景和效果。此外，本研究為了排除養(yǎng)殖廢水中外源微生物的影響而采用滅菌水作為試驗原料對篩選的菌株進行評價，后續(xù)將進一步采用未滅菌養(yǎng)殖廢水對其脫NH4+-N 功能進行研究，以深入揭示該菌在實際處理中的應用前景和效果。

4 結(jié)論

本試驗從養(yǎng)殖廢水污泥中分離獲得1 株自養(yǎng)氨氧化菌AH-7，經(jīng)過細胞形態(tài)觀察和16S rDNA 序列鑒定為亞硝化單胞菌（N.eutropha）。在本試驗條件下，該菌在滅菌廢水中有較好的NH4+-N 去除作用，NH4+-N 降解率達到92.59%，氨氧化速率達到16.87 mg/（L·d）。