李 浩 ，周 波，夏中生，鄒彩霞*，張 寧，黃偉杰，李 勝

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司，廣西南寧 530000；3.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)格林飼料有限公司，廣西貴港 537100；4.廣西南寧大動保生物科技有限公司，廣西南寧 530001）

在生豬養(yǎng)殖業(yè)中，通常在飼料中添加抗生素來促進(jìn)生長和預(yù)防疾病，但由于抗生素的濫用加大了細(xì)菌耐藥性和產(chǎn)品藥物殘留對消費者健康和生態(tài)環(huán)境的威脅。2019 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第194 號公告，決定自2020 年1 月1 日起正式禁止飼用促生長類抗生素，因此尋求抗生素替代品建立無抗飼糧成為研究者關(guān)注的焦點。Choi 等[1]和Pan 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌和益生元可以改善腸道微生物區(qū)系、提高營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和改善生長性能。

益生菌是活性微生物，當(dāng)其量足夠時可以給宿主的健康帶來益處[3]。益生菌通過緩解腸道微生物紊亂，減少腸道致病菌，從而促進(jìn)生長和提高飼料效率[4]、增加糞便中乳酸桿菌計數(shù)[5]等。研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌、丁酸梭菌和糞腸球菌可防止斷奶仔豬的大腸桿菌病，改善腹瀉發(fā)病率和生長性能[6]。低聚果糖（Fructooligosaccharide，F(xiàn)OS）又稱果寡糖，是益生元的一種。研究發(fā)現(xiàn)添加果寡糖可降低仔豬胃液pH，其通過調(diào)節(jié)腸道微生物群和發(fā)酵來改善豬胃腸道內(nèi)的穩(wěn)態(tài)[7]，改善生長性能[8-10]。但有關(guān)果寡糖、復(fù)合益生菌及其組合在生長育肥豬上的研究較少。本試驗旨在研究在生長育肥豬飼糧中添加果寡糖、復(fù)合益生菌及兩者組合替代抗生素對生長性能、養(yǎng)分消化率的影響，并探討直腸細(xì)菌相對豐度和養(yǎng)分表觀消化率的相關(guān)性，為其在生豬健康養(yǎng)殖上的運用和作用機理研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 果寡糖純度30%（剩余70% 是麥芽糊精），為廣西南寧某公司生產(chǎn)提供的“FOS30 粉劑”；益生菌為復(fù)合益生菌，含枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis），有效活菌數(shù)1×109CFU/g，由鹽城某公司生產(chǎn)提供“菌三寶”；抗生素為市售金霉素預(yù)混劑產(chǎn)品，含金霉素10%。

1.2 試驗設(shè)計 選取健康、體重30 kg 保育期結(jié)束的杜×長× 大仔豬560 頭，在飼養(yǎng)試驗開始前，按體重相近原則隨機分為5 組，每組4 個重復(fù)，每個重復(fù)28 頭豬（公、母各半，置于1 個欄內(nèi)），各組豬初始體重?zé)o顯著差異。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，金霉素組在基礎(chǔ)日糧中添加0.10%金霉素制劑，果寡糖組在基礎(chǔ)日糧中添加0.10%果寡糖，復(fù)合益生菌組在基礎(chǔ)日糧中添加0.02%復(fù)合益生菌，合生元組在基礎(chǔ)日糧中添加0.10%果寡糖和0.02%復(fù)合益生菌。

1.3 試驗日糧與飼養(yǎng)管理 試驗基礎(chǔ)飼糧參照NRC（2012）豬營養(yǎng)需要配制飼糧，試驗基礎(chǔ)日糧由廣西農(nóng)墾集團(tuán)金光畜牧有限公司提供，日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。試驗在廣西農(nóng)墾集團(tuán)金光畜牧有限公司大塘豬場進(jìn)行，預(yù)試期7 d，正試期60 d。自由采食和飲水，每日喂料2 次（08:00 和15:00），每次以吃飽后略有剩余為度（根據(jù)前1 d 的采食情況調(diào)整飼喂量），每天記錄采食量和健康狀況。

1.4 樣品采集和分析測定

1.4.1 生長性能 分別于試驗第0、20、40、60 天晨飼前稱重；每天觀察豬的采食情況，記錄飼料飼喂的重量與剩料重量，并計算平均日增重和耗料增重比。計算公式：

平均日增重=（末重－初重）/飼喂天數(shù)

耗料增重比=飼養(yǎng)期內(nèi)所耗標(biāo)準(zhǔn)飼料量（kg）/同期增重（kg）

1.4.2 內(nèi)源指示劑法測定飼糧養(yǎng)分表觀消化率 于飼養(yǎng)試驗結(jié)束前6 d 晨飼前，每組隨機選取12 頭（每組4個重復(fù)，每個重復(fù)3 頭），連續(xù)5 d 直腸取糞法采集約50 g 豬新鮮糞樣，分成2 份，其中一份加5 mL 濃度為10%的硫酸混合均勻進(jìn)行固氮，置于-20℃冷藏保存，用于測定養(yǎng)分表觀消化率，另一份置于無菌10 mL 離心管內(nèi)-80℃保存，用于測定直腸微生物。同時采集各組飼料樣本，并將糞樣、飼料樣本帶回實驗室待分析，糞樣、飼料樣于65℃烘干至恒重，粉碎，過40 目篩后干燥保存用于測定營養(yǎng)成分。粗蛋白質(zhì)采用全自動凱氏定氮儀（Vapodest 50s，德國 Gerhart）測定，粗纖維采用ANKOM200 半自動纖維測定儀（美國）測定，飼糧和糞中的粗灰分、有機物、干物質(zhì)含量采用張麗英[11]方法進(jìn)行測定。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4.3 高通量測序測定直腸細(xì)菌 將-80℃保存的無菌10 mL 離心管內(nèi)樣品送至廣西普斐信息科技有限公司測定直腸細(xì)菌組成。采用 Illumina HiSeq 測序平臺利用雙末端測序（Paired-End）的方法，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行雙末端測序。通過對Reads 拼接過濾，OTUs（Operational Taxonomic Units） 聚類，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，進(jìn)一步進(jìn)行α 多樣性分析（Alpha Diversity），結(jié)合環(huán)境因素進(jìn)行CCA/RDA 分析和多樣性指數(shù)與環(huán)境因子的相關(guān)性分析。引物設(shè)計：選擇V3+V4 區(qū)為測序區(qū)域，341F 和806R 引物序列分別為5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′ 和5′-GGACTACNNG GGTATCTAAT-3′。

1.5 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)由Excel 2010 整理后，由SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用Duncan's 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。直腸細(xì)菌測序數(shù)據(jù)使用PyNAST 軟件（Version 1.2）與GreenGene 數(shù)據(jù)庫中的“Core Set”數(shù)據(jù)信息進(jìn)行快速多序列比對[12]，得到所有OTUs 代表序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。最后對各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，以數(shù)據(jù)量最少的樣品為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)的Alpha 多樣性分析是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)，多樣性指數(shù)組間差異分析分別應(yīng)用Tukey 檢驗和wilcox 檢驗進(jìn)行有參數(shù)檢驗和非參數(shù)檢驗。利用古生物統(tǒng)計學(xué)3.0 軟件[13]和Spearman 秩相關(guān)系數(shù)檢驗[14]，分析養(yǎng)分表觀消化率與細(xì)菌屬水平物種相對豐度之間的關(guān)系。所得到的相關(guān)矩陣以熱圖格式可視化，并通過R軟件（版本3.6.0）使用“correlate”軟件包生成[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加果寡糖和益生菌及其組合對豬日增重、采食量和耗料增重比的影響 由表2 可得，在65～84 日齡，果寡糖組耗料增重比顯著低于對照組。在85～104 日齡，復(fù)合益生菌組的平均日增重和平均日采食量顯著低于對照組。在105～124 日齡，各試驗組平均日采食量和耗料增重比與對照組差異不顯著，添加復(fù)合益生菌顯著降低了平均日增重，其他試驗組與對照組差異不顯著。

2.2 添加果寡糖和益生菌及其組合對豬養(yǎng)分表觀消化率的影響 由表3 可知，與對照組相比，果寡糖組、復(fù)合益生菌組、合生元組均能顯著提高飼料粗蛋白質(zhì)、粗纖維、粗灰分、有機物和干物質(zhì)的表觀消化率，其中以復(fù)合益生菌組最佳。

2.3 添加果寡糖和益生菌及其組合對豬直腸細(xì)菌組成的影響 如圖1 所示，在對照組、金霉素組、果寡糖組、復(fù)合益生菌組、合生元組中Streptococcus和Lactobacillus的相對豐度分別占20.8%、16.4%、9.7%、10.6%、12.4% 和 15.0%、16.5%、20.0%、6.6%、8.7%；其余菌屬中只有復(fù)合益生菌組的Megasphaera相對豐度大于5%，果寡糖組的Lactobacillus相對豐度含量最高為20.0%；RuminococcaceaeUCG-005 和RuminococcaceaeUCG-002 的相對豐度含量均高于對照組、金霉素組，Clostridium sensu stricto1 相對豐度在合生元組最高為5.2%，在果寡糖組最低為3.3%。不論是在對照組還是處理組，在被檢出的 10 個主要菌屬中Streptococcus和Lactobacillus是育肥豬直腸的主要優(yōu)勢細(xì)菌群。

表2 添加果寡糖和益生菌及其組合對豬生長性能的影響

表3 添加果寡糖和益生菌及其組合對豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

圖1 添加果寡糖和益生菌及其組合對直腸細(xì)菌屬水平物種相對豐度的影響

由圖2 可知，Blautia、Ruminococcus gauvreauii group、Catenibacterium和Coprococcus3 與粗蛋白質(zhì)表觀消化率、粗纖維表觀消化率、粗灰分表觀消化率、有機物表觀消化率和干物質(zhì)表觀消化率均為顯著負(fù)相關(guān)。RuminococcaceaeUCG-002、Eubacterium coprostanoligenes group、RuminococcaceaeUCG-010、RikenellaceaeRC9gut group與粗蛋白質(zhì)表觀消化率、粗纖維表觀消化率、粗灰分表觀消化率、有機物表觀消化率和干物質(zhì)表觀消化率均為顯著正相關(guān)。

3 討 論

3.1 添加果寡糖和益生菌及其組合對豬生長性能、養(yǎng)分表觀消化率的影響 許多研究表明益生菌、益生元和合生元是良好的抗生素替代品[2,16-17]。董殿元等[18]研究發(fā)現(xiàn)添加0.35% 果寡糖對肥育豬后期（大于60 kg）的生長性能有顯著影響。而張雷等[19]研究發(fā)現(xiàn)，0.04%果寡糖對育肥豬的生產(chǎn)性能改善不顯著。本試驗中果寡糖對生長性能的影響不顯著，但可提高平均日增重、降低耗料增重比，研究結(jié)果的差異可能是果寡糖的添加量、豬日齡和日糧結(jié)構(gòu)不同所致。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼喂益生菌對育肥豬生產(chǎn)性能的效果隨著時間的推移逐漸增加；但合生元組效果略好于復(fù)合益生菌組；同時隨著飼喂時間的增加，復(fù)合益生菌組和合生元組豬的生長性能顯著好于其他組，這可能是腸道的益生菌不斷增加而使得豬生長性能有所改善。

研究發(fā)現(xiàn)益生菌、益生元能改善仔豬腸道微生物群和腸道形態(tài)，增加養(yǎng)分消化率[7,20-21]。本試驗中果寡糖組、復(fù)合益生菌組和合生元組能顯著提高粗蛋白質(zhì)、粗纖維、粗灰分、有機物和干物質(zhì)的消化率，與Suryanarayana等[22]、譚聰靈等[23]、Lei 等[24]在生長豬日糧添加果寡糖增強了營養(yǎng)物質(zhì)消化率的結(jié)果相似?？梢姽烟墙M、復(fù)合益生菌組和合生元組能通過改善生長育肥豬的腸道內(nèi)環(huán)境，從而促進(jìn)動物腸道健康，提高養(yǎng)分消化率。

3.2 添加果寡糖、益生菌及其組合對豬直腸細(xì)菌的影響由于糞便樣本易于采集常被用作調(diào)查腸道微生物區(qū)系[25]。本試驗在豬商品化養(yǎng)殖公司進(jìn)行，受條件所限無法采集到其他腸道樣品，因此，本試驗僅采集直腸內(nèi)容物。本試驗中直腸內(nèi)容物細(xì)菌組成測定結(jié)果顯示，果寡糖組、復(fù)合益生菌組和合生元組中細(xì)菌物種數(shù)量以及Alpha 多樣性均高于對照組和金霉素組，而對照組高于金霉素組，結(jié)果表明抗生素的使用降低了直腸細(xì)菌的相對豐度，與Knecht 等[26]研究發(fā)現(xiàn)抗生素的使用會降低腸道微生物的多樣性的結(jié)果一致。Zhao 等[27]研究發(fā)現(xiàn)隨著豬年齡的增加腸道微生物的Ace 指數(shù)、Chao 指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)顯著增加，糞便中微生物的豐富度和均勻度在發(fā)育階段是變化的。Zhang 等[28]研究發(fā)現(xiàn)金霉素組斷奶仔豬盲腸特有OUT 高于對照組和羅伊氏乳桿菌組。本試驗中對照組和復(fù)合益生菌組直腸細(xì)菌特有OTU 最高，與Zhang 等[28]的結(jié)果不一致，可能由動物日齡、環(huán)境和取樣位置不同所致。

圖2 豬直腸細(xì)菌屬水平與養(yǎng)分表觀消化率相關(guān)性

Streptococcus中不僅有許多致病細(xì)菌，而且有些鏈球菌可以產(chǎn)生乳酸（如乳酸乳球菌）。Whitehead 等[29]研究豬糞便微生物群時發(fā)現(xiàn)鏈球菌屬、乳桿菌屬和梭菌屬是主要的細(xì)菌；這與本試驗中鏈球菌屬、乳桿菌屬、巨型球菌屬和梭菌屬是直腸細(xì)菌屬水平的主要細(xì)菌的結(jié)果類似。Clostridium、Ruminococcaceae等菌屬在維持宿主機體健康方面具有至關(guān)重要的作用，被看作寄主不可缺少的功能生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)提供者[30]。有研究發(fā)現(xiàn)，果寡糖通過選擇性地促進(jìn)乳酸桿菌菌群中某些種類的細(xì)菌增殖和富集[31]。試驗中果寡糖組的Lactobacillus最高（20.0%），復(fù)合益生菌組最低（6.6%），而合生元組相對較低（8.7%）。這可能由于Lactobacillus能較好利用果寡糖，復(fù)合益生菌組的添加抑制Lactobacillus的生長，可以從合生元組的Lactobacillus高于復(fù)合益生菌組來解釋，而這方面的研究尚未見報道。

Arumugam 等[32]研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌對于碳水化合物的降解十分重要。本試驗同樣發(fā)現(xiàn)，Bacteroidees與粗纖維表觀消化率呈顯著正相關(guān)。Niu 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，不同階段的生長豬粗纖維消化率與11 屬（Anaeroplasma、Campylobacter、Enterococcus、Clostridium、Methanob revibacter、Nitrosospira、Propionibacterium、Pseudobu tyrivibrio、Robinsoniella、Staphylococcus和Treponema）相關(guān)；在本試驗中，屬水平上有24 個屬呈顯著相關(guān)性。而關(guān)于豬腸道或直腸微生物與粗蛋白質(zhì)、粗灰分、有機物和干物質(zhì)表觀消化率的相關(guān)性未見有報道。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加果寡糖以及果寡糖與益生菌合生元組制劑（合生元）替代抗生素能改善生長育肥豬的生長性能，而單獨添加復(fù)合益生菌對生長性能有一定的負(fù)面影響，但統(tǒng)計分析差異不顯著；試驗中果寡糖組、復(fù)合益生菌組和合生元組通過改善直腸細(xì)菌區(qū)系、增加直腸細(xì)菌多樣性，從而增加與養(yǎng)分消化率有關(guān)的細(xì)菌豐度，提高養(yǎng)分表觀消化率。