崔艷穎，史秀杰，張美佳，楊 健，武占營，郝肖瓊,*

（1.包頭醫(yī)學院生理學教研室，內蒙古包頭 014040；2.深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心，廣東深圳 518026；3.中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物技術國家重點實驗室，北京 100193）

精液冷凍保存技術對豬和牛等優(yōu)良家畜的快速繁殖以及瀕危動物的拯救具有重大實踐意義，準確而客觀地評價精子受精能力可使優(yōu)良精子資源得到充分利用。精液質量的評價指標主要包括精子的直線運動狀態(tài)、活率、質膜完整性、頂體完整率等[1]，精子的運動狀態(tài)可利用計算機輔助精子分析儀 （CASA） 來分析[2]，該方法準確客觀，但有些精子雖具有良好的運動能力，卻無受精能力[3]。研究認為，精液冷凍-凍融過程中精子質膜最易受損，同時精子DNA 也會受到影響[4]，這些都會導致精子的受精能力下降[5]，因此，精子DNA 損傷程度也是評價精液品質的一個指標[6-7]。精子線粒體是維持精子活力的關鍵細胞器[8-10]，精子直線運動能力和線粒體活性密切相關；線粒體膜通道孔的開放能夠顯著改變線粒體的通透性[11]，也是評價精液品質的依據(jù)。此外，線粒體耗氧量也是檢測精子線粒體功能的一個指標[12-13]。

冷凍精液不同保存時間會導致精子受精能力不同，本實驗旨在檢測不同保存時間的牛凍精的精子活力、DNA 完整性和線粒體功能等并分析功能指標與受精能力的相關性，為建立既快速又能準確反映牛凍精受精能力的方法、評價牛冷凍精液受精能力奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 冷凍精液來源 3 批荷斯坦奶牛冷凍精液分別為A 凍精（2018 年冷凍，保存1 年）、B 凍精（2016 年冷凍，保存3 年）和C 凍精（2006 年冷凍，保存13 年），均來自于北京奶牛中心。每批鮮精都來自4 頭種公牛，采用相同的冷凍方法冷凍，液氮保存。精液在冷凍前后均進行各項指標檢測，3 批精液精子活力、活率、直線運動狀態(tài)、頂體染色率等指標在鮮精或者凍精間沒有差異。

1.1.2 實驗試劑及儀器 實驗所用試劑均購自Sigma 公司，培養(yǎng)液購自Gibco 公司，通用型DNA 損傷彗星檢測試劑盒、MTT 比色法細胞繁殖定量檢測試劑盒、活體細胞線粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測試劑盒、活體細胞線粒體內膜功能（膜電位）熒光測定試劑盒、精子活力和頂體反應三色染色試劑盒、呼吸鏈依賴性純化線粒體氧化應激活性氧熒光測定試劑盒購自上海杰美基因。正置光學顯微鏡（Olympus，日本）；熒光顯微鏡（Leica，德國）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific，美國）；偉力精子分析儀WLJY-9000（北京偉力新世紀科技發(fā)展有限公司，中國）；電熱恒溫水浴箱（精宏 KD-S24，中國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 精子運動狀態(tài)檢測 利用偉力精子分析儀檢測3批牛冷凍精液的精子活力、運動前向行、直線運動速度、曲線運動速度、直線性、擺動性、和鞭打頻率。

1.2.2 精子頂體完整率測定 按照精子活力和頂體反應三色染色試劑盒說明書操作，光學顯微鏡觀察并計數(shù)（每個視野計數(shù)200 個精子）。其中，著粉紅色為頂體完整精子，頂體未著色為頂體不完整精子（頂體內含物丟失，故未著色）。

1.2.3 精子活率檢測 精子胞膜具有選擇透過性，活精子的胞膜完整，臺盼藍拒染；而喪失活性或細胞膜不完整的精子細胞喪失選擇透過性，可被臺盼藍染成藍色。利用臺盼藍染色后統(tǒng)計拒染精子所占精子的百分比，光學顯微鏡觀察精子染色情況。

1.2.4 線粒體功能檢測 按照活體細胞線粒體膜通道孔熒光檢測試劑盒說明書操作檢測精子細胞線粒體膜通道孔（MPTP），線粒體膜通道孔相對熒光單位（RFU）值降低，表明膜通道孔活性增強。利用MTT 比色法細胞繁殖定量檢測試劑盒檢測精子線粒體活性，吸光值與細胞量呈線性正相關，能夠反映線粒體活性。利用活體細胞線粒體內膜功能（膜電位）熒光測定試劑盒檢測精子線粒體膜電位（MMP）。利用呼吸鏈依賴性純化線粒體氧化應激活性氧熒光測定試劑盒檢測線粒體氧化應激活性氧（ROS）。

1.2.5 精子DNA 完整性檢測 利用通用型DNA 損傷彗星檢測試劑盒檢測精子DNA 完整性，DNA 損傷后其DNA 碎片拖尾，形成典型的“彗星”圖像，根據(jù)遷移長度和熒光強度即可定量分析DNA 損傷的程度。在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.6 牛冷凍精液的受精能力檢測 牛卵母細胞培養(yǎng)：牛卵巢采自河北省屠宰場，保存于28～30℃生理鹽水，2 h 內運至實驗室，用含有青、鏈霉素的37℃生理鹽水洗滌卵巢3 次，采用真空泵和18 號針頭抽取直徑為2～6 mm 卵泡中的卵泡液，顯微鏡下挑選包含3 層及3 層以上卵丘細胞且胞質均勻的卵丘卵母細胞復合體（COCs），放入四孔板（每孔50 枚），置于38.5℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22～24 h；體外成熟培養(yǎng)液包含TCM-199、0.01 IU/mL 促卵泡素（FSH）、10 IU/mL 促黃體生成素（LH）、1 μg/mL 雌二醇（E2）。體外受精（IVF）操作：成熟后的COCs 去除外周部分卵丘細胞，放于50 μL 的受精液滴中，每滴放入15～20枚 COCs，將精子和卵母細胞在38.5℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中共孵育8～16 h；受精液：112.0 mmol/L NaCl、4.02 mmol/L KCl、2.25 mmol/L CaCl2?2H2O、0.52 mmol/L MgCl2?6H2O、0.83 mmol/L KH2PO3、37.0 mmol/L NaHCO3、1.25 mmol/L 丙酮酸鈉、10 μg/mL Heparin、4 mg/mL BSA、10 mmol/L 咖啡因、雙抗（100 U/mL 青霉素+100 μg/mL 鏈霉素）。體外胚胎培養(yǎng)：利用玻璃針去除體外受精后8～16 h 受精卵外周卵丘細胞，將受精卵在前期胚胎培養(yǎng)液中洗3 遍，放入38.5℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后換入后期胚胎培養(yǎng)液，此后每隔48 h 進行半量換液，并在2 d 和7 d 分別統(tǒng)計早期胚胎的卵裂率和囊胚率（囊胚率的統(tǒng)計以卵裂數(shù)為總數(shù)）。

1.2.7 基因表達分析 復蘇3 批冷凍精液之后，總RNA提取依照RNeasy micro-RNA isolation kit（Qiagen，美國）操作指南進行，反轉依照QuantiTek（Qiagen，美國）反轉錄體系進行，得到cDNA，Real-time PCR 方法檢測目的基因精子線粒體相關半胱氨酸富集蛋白（SMCP）、不溶性彈性蛋白3（TEKT3）、軸絲動力蛋白1 （DNAH1）及T 復合體相關睪丸表達3（TCTE3）的相對表達量。相關引物序列見表1。

1.2.8 統(tǒng)計分析 所有實驗均重復3 次。用Sigma plot 13.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)類型采用方差分析（ANOVA）和t檢驗，結果以平均值±標準誤差表示，P<0.05 為有顯著性差異。

表1 引物序列

2 結果

2.1 不同冷凍時間對牛精子運動狀態(tài)的影響 如表2 顯示，隨冷凍時間延長，精子活力和運動直線性均顯著下降。

2.2 不同冷凍時間對牛精子活率的影響 如圖1 所示，A 精液的精子活率（91%）顯著高于B（67%）、C 精液（59.67%）。

2.3 不同冷凍時間對牛精子頂體完整率的影響 如圖2 所示，A、B、C 3 批凍精的精子頂體完整率分別為98.13%、94.36%、88.28%，均高于國家標準 （標準≥82%）。

2.4 牛冷凍解凍精液體外受精能力檢測 如圖3 所示，A、B 和C 3 批冷凍精液的卵裂率分別為70.77%、62.89%、51.90%；囊胚率分別為30.47%、25.14%、16.43%。說明隨冷凍保存時間延長，精液的受精能力顯著下降。

2.5 精子線粒體功能分析 如圖4 所示，線粒體膜通道孔的結果顯示，A 精液RFU 值最高，B 精液次之，C 精液RFU 值最低（P<0.05），表明A 精液線粒體的膜通道孔活性最高；線粒體膜電位結果顯示，A 精液最好；MTT 法間接測定精子線粒體活性的實驗結果顯示，A精液的光密度（Optical Density，OD）值最高（P<0.05），表明精液質量最好；線粒體氧化應激活性氧的測定顯示，A 精液ROS 最低（P<0.05）。

2.6 冷凍精液DNA 損傷檢測 如圖5 所示，A 精液拖尾最短（P<0.05），B 精液其次，C 精液拖尾最長（P<0.05），表明A 精液精子的DNA 碎片最少，DNA 損傷最輕，而C 精液精子的DNA 碎片最多，DNA 損傷程度最嚴重。

2.7 不同保存時間對弱精子癥相關蛋白基因表達水平的影響 如圖6 所示，4 種基因的表達趨勢未顯現(xiàn)出如IVF 實驗結果相一致的趨勢，表達差異不顯著。

圖1 牛凍精解凍后精子臺盼藍染色

圖2 牛凍精解凍后精子頂體完整率

圖3 不同保存時間牛冷凍精液的IVF 后期胚胎發(fā)育情況

表2 不同冷凍時間對牛精子運動狀態(tài)的影響

圖4 不同保存時間牛冷凍精液精子線粒體功能分析

圖5 不同保存時間牛冷凍精液精子DNA 損傷測定

圖6 不同保存時間對牛冷凍精液弱精子癥相關基因表達的影響

3 討 論

精液冷凍保存技術對于大型哺乳動物的人工繁育至關重要。本研究對不同冷凍時間的3 批荷斯坦奶牛精液進行了檢測，由于冷凍時間跨度較長（1 年、3 年及13 年），沒有使用同一批冷凍的精液，但精液來源于同一品種公牛，3 批精液精子活力、活率、直線運動狀態(tài)、頂體染色率等指標在鮮精或者凍精間沒有差異。本實驗中，不同時期的?？赡苌杂杏绊懀绊懢庸δ艿闹饕抢鋬霰４鏁r間。

精子的活率、活力是影響精子受精能力的重要因素[6]。本研究中凍精的精子活力和活率在保存3 年后顯著下降，但繼續(xù)保存至13 年，下降不明顯，說明精子活率和活力主要在冷凍保存早期下降，短期冷凍對其影響較小，超過3 年后，精子活率及活力不再顯著下降。精子的直線運動狀態(tài)與母牛的受孕率關系密切。冷凍保存1年的精子直線運動性最高，保存3 年后，下降不明顯，而保存13 年后精子的直線運動性顯著下降，結果表明短時間的冷凍保存主要使精子的活力和活率下降，而長時間的冷凍主要使精子的直線運動性下降，導致受精能力下降。哺乳動物頂體的頂體反應是受精過程中的一個重要環(huán)節(jié)，冷凍精液中精子頂體的完整率是衡量精液品質的一個重要指標[14]。本研究表明，冷凍時間的延長對精子頂體完整率影響不明顯。

體外受精能力最能真實、客觀、準確地反映精液品質[6]。本研究結果表明，冷凍保存1 年的牛精液的卵裂率和囊胚發(fā)育率與以前報道的牛冷凍精液的受精率結果相似[15-16]，然而，冷凍保存3 年的精液受精率和囊胚發(fā)育率明顯下降，冷凍保存13 年的精液囊胚發(fā)育率進一步下降，這表明冷凍精液保存1 年對受精率影響不大，但隨著冷凍保存的時間延長，精子的受精能力會顯著下降。

精子線粒體是精子運動的能量來源，因此線粒體功能狀態(tài)是影響精子受精能力的一個重要因素。線粒體活性、MMP 及MPTP 結果均表明，凍存將對牛精液精子線粒體功能造成嚴重損傷，這與之前關于綿羊精液精子線粒體的報道相一致[17]，且凍存時間越長，線粒體功能受損程度越嚴重，這可能是由于細胞凋亡或壞死時，線粒體內容物通過膜通道孔釋放到胞漿中，膜通道孔開放，顯著增加了線粒體的通透性[12]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，3 批精液精子的DNA 均有碎片，表明牛精子冷凍會增加核DNA 碎片，這與冷凍對人類精子核DNA 造成損傷的研究結果相一致[18-19]；凍存1 年的精子的DNA 碎片較少，冷凍保存3 年后 DNA 碎片極顯著增加，冷凍保存13 年的精子DNA 碎片進一步增加，這些結果表明精液冷凍導致線粒體膜通道孔通透性和DNA 損傷的變化幅度最大，可能是導致精子受精能力下降的內在因素。

3 批牛冷凍精液精子中弱精子癥相關基因的表達并無明顯變化，可能是冷凍保存并不會導致遺傳異常，而弱精癥相關基因的表達主要受遺傳物質影響，這與郭靚等[20]研究海福特公牛凍精保存35年并未發(fā)現(xiàn)遺傳異常相一致。

4 結 論

本實驗結果顯示，隨著冷凍時間的延長，精子的活力、直線性、活率、線粒體活性、MPTP、受精能力、DNA 完整性等指標均下降，其中MPTP 和DNA 完整性指標變化幅度最大，可作為判斷牛冷凍精液受精能力的參考指標。