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        大豆卵磷脂與卵黃在山羊精液冷凍過程中的聯(lián)合作用研究

        2020-09-18 03:48:48范文華戴建軍張樹山孫玲偉吳彩鳳張德福
        中國畜牧雜志 2020年9期

        范文華,戴建軍,張樹山,孫玲偉,吳彩鳳,張德福*

        (1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106;2.上海農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室,上海 201106;3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306)

        家畜精液冷凍通常以卵黃(EY)作為冷凍保護(hù)劑,但EY 成分復(fù)雜且安全性頗受質(zhì)疑[1]。大豆卵磷脂(SL)富含低密度脂蛋白(LDL),可在精子冷凍過程中作為無動物源性冷凍保護(hù)劑保護(hù)精子膜免受低溫?fù)p傷,并已得到部分應(yīng)用[2-3]。如蔡虹[4]在牛精液冷凍中添加3%SL,解凍后活力和畸形率與EY 對照組均無顯著性差異;胡傳水等[5]以1.5%SL 完全取代20%EY 稀釋液,解凍后精子質(zhì)量與對照組無顯著性差異;Forouzanfar 等[6]研究發(fā)現(xiàn)使用1%SL 可替代20%EY 冷凍保存綿羊精液。Sun 等研究發(fā)現(xiàn)[7],山羊冷凍過程中SL 的最佳添加濃度為2%,目前未見SL 和EY 在精液冷凍過程中聯(lián)合應(yīng)用的報道。本實驗將EY 和SL 按一定比例混合配制稀釋液,解凍后觀察精子活率、精子活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和線粒體活性,并通過檢測抗氧化指標(biāo)確定EY 和SL 在山羊精液冷凍過程中是否有協(xié)同作用。

        1 材料與方法

        1.1 動物和試劑 除特別說明外,所有試劑均購自Sigma 公司,超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購于碧云天公司。采精用的8 頭崇明白山羊種公羊來源于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食草動物綜合試驗站,

        1.2 稀釋液的配制 基礎(chǔ)稀釋液的配制:稱取檸檬酸1.825 2 g、葡萄糖0.504 4 g 和 TRIS 3.634 2 g,溶解后加入200 IU/mL 雙抗(河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司)、6 mL甘油,混勻,定容至100 mL。

        試驗共分5 組,分別在基礎(chǔ)稀釋液中添加20%EY、2%SL、10%EY+2%SL、20%EY+1%SL、20%EY+2%SL。

        1.3 精液采集 山羊精液采用假陰道法采集,經(jīng)常規(guī)檢測,精子活率在80%以上的精液方可用于后續(xù)試驗。

        1.4 精液冷凍 將8 頭種公羊精液混合,平均分成5 份,按精液∶冷凍稀釋液體積比1:3 加入稀釋液混勻,移至4℃環(huán)境低溫平衡2 h。平衡后樣品在4℃環(huán)境下快速分裝為0.25 mL 細(xì)管精液,移入液氮面上3 cm,熏蒸15 min 后迅速投入液氮中超低溫冷凍保存。

        1.5 精液解凍 將液氮中保存的細(xì)管取出,投入70℃水浴鍋內(nèi)解凍5 s,按精液:稀釋液體積比1:10 稀釋后混勻,于37℃水浴鍋中孵育10 min。

        1.6 精子質(zhì)量檢測

        1.6.1 精子活率與活力 使用計算機(jī)輔助精液分析儀(邁朗,SJ-TMDI608)測定精子活率和精子活力,每個樣品隨機(jī)選取4 個視野(n ≥200)。

        1.6.2 頂體完整率 吉姆薩染色法測定精子頂體完整率[8]。解凍后精液使用預(yù)熱的無甘油基礎(chǔ)稀釋液50 倍稀釋后涂片,風(fēng)干。甲醇固定15 min 沖洗干凈。使用吉姆薩染色12 h,沖洗干凈,風(fēng)干后鏡檢,精子頂體結(jié)構(gòu)明顯染色,頂體完整、外形正常或頂體輕微膨脹為頂體完整精子,頂體嚴(yán)重膨脹或頂體脫落為頂體畸形精子[9]。1000×顯微鏡下隨機(jī)選取4 個視野(n ≥200)觀察統(tǒng)計頂體完整率。

        1.6.3 質(zhì)膜完整率 低滲腫脹試驗(HOST)測定精子質(zhì)膜完整性[10]。將10 μL 精液與100 μL 100 mOsm 低滲溶液(0.9 g 果糖和0.49 g 檸檬酸鈉溶于100 mL 蒸餾水)混勻,37℃孵育30 min,相差顯微鏡(×400)下隨機(jī)觀察4 個視野(n ≥200),精子尾部卷曲為質(zhì)膜完整,無卷曲表明精子質(zhì)膜不完整,計算出質(zhì)膜完整精子的百分比。

        1.6.4 線粒體活性檢測 待測樣品稀釋至1.5×106/mL,加入10 μL 的羅丹明123(1 μmoL/L)和10 μL 碘化丙啶(1 mg/mL)混合,37 ℃避光孵育30min 后,吸取10 μL 樣品制片。在400×倒置熒光顯微鏡,波長520 nm下隨機(jī)選取4 個視野(n ≥200)觀察,精子呈現(xiàn)紅色熒光為死精,精子尾部呈現(xiàn)綠色熒光有線粒體活性[11]。統(tǒng)計各組百分率。

        1.6.5 抗氧化指標(biāo)檢測 精子冷凍-解凍后ROS、MDA和SOD 水平分別采用碧云天公司提供的試劑盒檢測。

        1.7 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),差異顯著時采用Duncan′s 方法對各組間平均數(shù)進(jìn)行多重比較,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,P<0.05 表示差異顯著。

        2 結(jié)果

        2.1 EY 和SL 及其聯(lián)合添加對山羊凍精質(zhì)量的影響 由表1 可知,10%EY+2%SL 組解凍后精子質(zhì)量最高,其精子活率、精子活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率顯著高于20%EY+1%SL 組和20%EY+2%SL 組,與20%EY 對照組和2%SL 組無顯著差異。

        表1 不同冷凍稀釋保護(hù)劑對崇明白山羊凍精質(zhì)量的影響 %

        2.2 EY 和SL 及其聯(lián)合添加對山羊凍精線粒體活性的影響 圖1 在3 組聯(lián)合添加組中,10%EY+2%SL 組解凍后精子的線粒體活性顯著高于另外2 組,但與20%EY對照組和2%SL 組無顯著差異,20%EY+1%SL 組和20%EY+2%SL組的線粒體活性顯著低于20%EY和2%SL組。

        圖1 EY 和SL 及其聯(lián)合添加對精子線粒體活性的影響

        2.3 EY 和SL 及其聯(lián)合添加對山羊凍精抗氧化能力的影響如圖2 所示,10%EY+2%SL 組解凍后精子的SOD 值為150.77 U/mL,顯著高于20%EY+1%SL 組(102.19 U/mL)和20%EY+2%SL 組(101.17 U/mL),但與20%EY 對照組(151.74 U/mL)和2%SL 對照組(147.18 U/mL)無顯著性差異。10%EY+2%SL 組、20%EY 對照組和2%SL對照組的ROS 和 MDA 水平均顯著低于20%EY+1%SL和20%EY+2%SL 組。

        3 討 論

        圖2 EY 和SL 及其聯(lián)合添加對山羊凍精抗氧化能力的影響

        EY 作為家畜精液冷凍保護(hù)劑,易在精液冷凍和后續(xù)體外受精過程中帶來微生物污染,且山羊精漿中的卵黃凝固酶可將EY 中的卵磷脂水解為脂肪酸和溶血卵磷脂,而后者對山羊精子的活力和頂體產(chǎn)生損害作用[12]。本研究首次在冷凍稀釋液中添加SL 以替換或降低EY使用濃度,結(jié)果表明冷凍稀釋液中使用2% 的 SL 可完全替代EY,取得了與20%EY 組相近的冷凍解凍效果。SL 主要包括磷酯類和非磷脂類物質(zhì),磷酯類物質(zhì)大部分為LDL。研究證實,降溫會造成精子質(zhì)膜上的磷脂發(fā)生從液晶態(tài)到凝膠態(tài)的相位轉(zhuǎn)變,降低精子膜的流動性,導(dǎo)致膜剛性增強,易受冰晶物理傷害,SL 中的LDL 能為受損的精子膜提供外源性磷脂,從而降低精子膜相位轉(zhuǎn)變溫度,以便于冷凍過程中精子脫水,提高精子質(zhì)膜和頂體對冷凍傷害的耐受性,同時也可作為外源性磷脂來替代修補超低溫?fù)p傷的精子膜磷脂,從而維持質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能,防止精子冷休克[13-15]。另一方面,LDL 可在細(xì)胞周圍形成保護(hù)層,以防止快速降溫細(xì)胞冰晶的形成,保護(hù)精子膜在冷凍-解凍過程中免受機(jī)械損傷[16]。本研究也證實了SL 在山羊精液冷凍中具有與EY 相似的冷凍保護(hù)效果。

        精液冷凍過程中,10%EY+2%SL 組獲得了最高冷凍效率,可能與SL 的添加降低EY 使用濃度,減少卵黃凝固酶(EYCE)對精子的毒害作用有關(guān)。EYCE 可誘導(dǎo)稀釋液中卵黃凝結(jié),催化卵黃脂類物質(zhì)中脂肪酸的釋放,造成精液pH 下降,從而導(dǎo)致孵育后精子死亡。結(jié)果表明,與單獨添加EY 或SL 相比較,10%EY+2%SL組解凍后精子質(zhì)膜和頂體完整性提高的主要原因可能是EY 和SL 的聯(lián)合添加可能會彌補卵磷脂單一來源的局限性,改善冷凍效果。然而,這兩種冷凍保護(hù)劑之間的相互作用尚不清楚。有研究表明,稀釋液中的EY 會加速精子發(fā)生獲能反應(yīng),降低精子存活時間,因此在冷凍過程中,降低稀釋液中的EY 濃度,同時利用SL 補充添加冷凍所需的必須成分,可更好地保護(hù)精子的頂體[17]。本實驗中10%EY+2%SL 聯(lián)合添加組亦獲得了最佳的精子活力、精子活率、質(zhì)膜完整性和頂體完整性。

        本實驗未發(fā)現(xiàn)EY 和SL 存在協(xié)同作用,20%EY+1%SL 組和20%EY+2%SL 組山羊精子解凍后的精子活率、精子活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和線粒體活性均顯著低于10%EY+1%SL 組,可能是因為高濃度EY 稀釋液再聯(lián)合添加其他來源的卵磷脂將導(dǎo)致稀釋液中卵磷脂濃度增加,加大稀釋液黏稠度,使精子游動阻力增大,消耗更多ATP。大量ATP 消耗將會使精子提前獲能,獲能是精子凋亡的誘因之一,同時部分精子提前發(fā)生頂體反應(yīng),進(jìn)而喪失受精能力。精子運動所需要的 ATP 大部分來自線粒體,因此精子的運動能力與線粒體活性密切相關(guān)。Del 等[18]在綿羊精液冷凍中使用3.5%SL 作為冷凍保護(hù)劑,解凍后精子線粒體活性顯著降低。SL 超過一定濃度會誘導(dǎo)線粒體跨膜電位降低,引起線粒體膜內(nèi)外發(fā)生生化改變,導(dǎo)致ATP 合成酶等與驅(qū)動 ATP 合成有關(guān)的大分子物質(zhì)丟失,從而降低ATP 合成,對精子運動產(chǎn)生不可逆影響。

        線粒體活性直接影響精子運動能力,而線粒體損傷亦與精子的氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)。冷凍保存過程中溫度的變化會對精子產(chǎn)生物理性、化學(xué)性和氧化性損傷。氧化應(yīng)激可能會導(dǎo)致線粒體功能喪失、DNA 斷裂、染色體損傷,從而導(dǎo)致精子運動和受精能力降低、情期妊娠率與產(chǎn)仔率下降、羔羊畸形率增加等現(xiàn)象。精子細(xì)胞內(nèi)線粒體在精子代謝過程中產(chǎn)生大量ROS,活性氧自由基可引起精子膜上脂質(zhì)過氧化,產(chǎn)生MDA,造成細(xì)胞損傷凋亡的同時還能對精子基因組造成傷害[19]。精子內(nèi)的SOD 在凍精中可有效清除ROS 氧化損傷產(chǎn)生的多種活性氧物質(zhì),這些活性氧物質(zhì)對富含多不飽和脂肪酸的精子細(xì)胞產(chǎn)生潛在危害。本實驗結(jié)果表明,山羊精液冷凍稀釋液中聯(lián)合添加10%EY+2%SL 時的精子SOD 含量顯著高于20%EY+1%SL 組和10%EY+2%SL 組,ROS水平顯著降低,與2%SL 組和20%EY 組無顯著性差異,表明聯(lián)合添加10%EY+2%SL 在降低氧化損傷效果上與單獨添加EY 和SL 冷凍保護(hù)劑保持一致,并與精子的運動、質(zhì)膜與頂體完整性數(shù)據(jù)相呼應(yīng)。10%EY 聯(lián)合添加SL 可部分提高精子抗氧化損傷能力、降低氧化損傷,減少精子細(xì)胞膜損傷,提高精子活力。20%EY 聯(lián)合添加SL 則表現(xiàn)為對精子的促氧化損傷,嚴(yán)重影響凍精質(zhì)量。

        4 結(jié) 論

        本研究結(jié)果表明,在山羊精液冷凍保存中,添加2%SL 對解凍后精液質(zhì)量沒有任何不利影響,可以作為精液冷凍保護(hù)劑有效代替EY;聯(lián)合添加EY 和SL 并無明確的協(xié)同作用,20%EY 聯(lián)合添加SL 甚至?xí)鋈诤缶赢a(chǎn)生毒害作用。

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