李興才，潘成勇，李 輝*，楊華婷

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州大學(xué)貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州貴陽 550025；3.凱里鳳凰苑畜牧養(yǎng)殖有限公司，貴州凱里 556000）

微衛(wèi)星是指第二代遺傳標(biāo)記，又稱簡單重復(fù)序列或串聯(lián)重復(fù)序列，其片段小，結(jié)構(gòu)簡單，一般不超過500 bp，具有1～30 次的重復(fù)[1]。由于微衛(wèi)星在基因組中具有數(shù)量龐大、分布廣、多態(tài)信息量豐富、共顯性遺傳等特點，通常被廣泛用于動物起源、親緣關(guān)系、遺傳多樣性等研究[2]，如吳信生等[2]、樊斌等[3]、王斌等[4]利用微衛(wèi)星標(biāo)記分別對雞、豬、牛的遺傳多樣性與親緣關(guān)系進行分析，黃勛和等[5]、劉偉等[6]、屠云潔等[7]利用相同技術(shù)分析了不同地方雞種的起源以及遺傳多樣性豐富程度。

香爐山雞系貴州省凱里地區(qū)苗族人民從中原遷徙到西南后，在香爐山地區(qū)長期封閉的自然條件下形成的原始類群。香爐山雞體型矮小、結(jié)實緊湊、結(jié)構(gòu)勻稱，具有耐粗飼、抗逆性強、肉質(zhì)鮮美等特點[8-9]。目前，對香爐山雞的研究主要集中于宏觀選育方面，分子研究鮮有報道，為了更好地保護、開發(fā)、利用這一類群，有必要對其遺傳多樣性豐富程度進行評價。因而，本研究采用21 個微衛(wèi)星標(biāo)記對香爐山雞遺傳多樣性進行研究，以期為該類群的保種和選育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗樣品來自貴州省黔東南州凱里市鳳凰苑畜禽養(yǎng)殖有限公司種雞擴繁場，使用EDTA 抗凝管翅靜脈采血，隨機采取香爐山種雞121 只血液樣品，公雞60 只，母雞61 只，采血過程中快速顛倒混勻放于低溫泡沫盒帶回實驗室，-20℃保存用于總DNA 提取。

1.2 基因組DNA 提取 香爐山雞總DNA 利用血液基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）進行提取，紫外分光光度計檢測其濃度，OD 值在1.8～2.0為合格。同時利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對其完整性進行檢測，合格總DNA 樣品放于-20℃冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物及PCR 擴增 從聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO）和國際動物遺傳學(xué)會（ISAG）聯(lián)合推薦的30 個微衛(wèi)星標(biāo)記引物中篩選多態(tài)性比較豐富、擴增效果比較好的21 個微衛(wèi)星標(biāo)記引物對香爐山雞遺傳多樣性進行分析，序列如表1 所示，引物送往上海英濰捷基生物有限公司進行合成。

PCR 擴增體系為20 μL，其中上下游引物（10 pmol/μL）各1 μL，模板DNA（90 ng/μL）1 μL，2×Es Taq Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性35 s、54.7～63℃退火40 s、72℃延伸40 s，35個循環(huán)；72℃終延伸6 min，4℃保存。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測是否有條帶，8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染、拍照保存，經(jīng)生物軟件整理用于后續(xù)遺傳多樣性分析。

表1 21 個微衛(wèi)星標(biāo)記引物序列信息

1.4 統(tǒng)計分析 以PBR322/Msp I DNA 分子量為標(biāo)準(zhǔn)，利用GeneMapper 分子軟件進行片段標(biāo)定并作基因型判定，將香爐山雞聚丙烯酰胺凝膠電泳分型結(jié)果記錄，利用Popgene1.32 軟件計算其等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shanon 指數(shù)、多態(tài)信息含量、觀察雜合度、期望雜合度、等位基因頻率等。

2 結(jié)果與分析

2.1 香爐山雞21 個微衛(wèi)星標(biāo)記的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果 由圖1 可知，MCWO111 位點檢測部分電泳結(jié)果條帶明顯、清晰明亮，分型效果比較好，利于準(zhǔn)確判定基因型。

2.2 香爐山雞21 個微衛(wèi)星標(biāo)記的基因型頻率 如表2 所示，21 個微衛(wèi)星標(biāo)記的基因型頻率在0.057 9～0.686 0 之間，其中最低基因型頻率出現(xiàn)在MCW134 和LEI0234位點上，最高出現(xiàn)在MCWO037 位點。

圖1 MCWO111 位點在香爐山雞群體中的8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的部分圖譜

2.3 香爐山雞21 個微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因頻率 檢測結(jié)果顯示，21 個微衛(wèi)星位點上共檢測出85 個等位基因，每一個位點檢測到3～6 個等位基因，平均等位基因數(shù)為4.047 6 個，如表3 所示。其中，等位基因數(shù)檢測最多的位點是MCW0014（6 個），最低的位點為MCW134、LEI0166、MCW0206、ADLO278、MCW0069 位點（3 個）；等位基因頻率在0.037 2～0.789 3；21 個微衛(wèi)星位點等位基因頻率分布不均勻，但都呈現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，說明群體遺傳多樣性比較豐富。

2.4 香爐山雞21 個微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性 由表4可知，香爐山雞平均有效等位基因數(shù)為2.955 0，平均Shanon 指數(shù)為1.170 8，平均多態(tài)信息含量為0.580 7，最高等位基因數(shù)、最高Shanon 指數(shù)和最高PIC 均在MCW0216 位點，最低為MCWO037 位點。21 個微衛(wèi)星標(biāo)記有15 個為高度多態(tài)（多態(tài)信息含量>0.5），6 個為中度多態(tài)位點（0.25<多態(tài)信息含量<0.5），說明香爐山雞遺傳多樣性比較豐富；平均觀察雜合度為0.575 7；平均期望雜合度為0.637 1，群體內(nèi)雜合子數(shù)量比較多，說明該雞群還存在一定的選育空間。

表2 香爐山雞21 個微衛(wèi)星標(biāo)記的基因型頻率

3 討 論

等位基因數(shù)是基因純合度的倒數(shù)，因此可以反映群體間的遺傳變異均勻程度，等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)越接近，群體間的差異越小，選育空間越小[10]。本研究結(jié)果顯示等位基因數(shù)為4.047 6、有效等位基因數(shù)為2.955 0，兩指標(biāo)差異較大，說明香爐山雞群體遺傳多樣性比較豐富，還存在一定的選育空間。

多態(tài)信息含量通常是用于評價群體遺傳多樣性的一個關(guān)鍵性指標(biāo)，研究表明多態(tài)信息含量小于0.25 為低度多態(tài)，在0.25～0.5 為中度多態(tài)，大于0.5 為高度多態(tài)[11]。本研究得出香爐山雞平均多態(tài)信息含量為0.580 7，為高度多態(tài)，說明群體具有豐富的遺傳多樣性；相比于陳紅菊等[12]對山東5 個地方雞品種的研究結(jié)果（0.700 8、0.619 6、0.671 2、0.702 7、0.668 2）略低，與曲魯江等[13]對中國地方雞種和吳信生等[2]對中國部分地方雞種的研究結(jié)果（0.573 0、0.437 4）相比偏高，但與張勇等[14]、韓雪等[15]、伍革民等[16]對貴州省地方雞種的研究結(jié)果（0.629 7、0.659 7、0.678 0）相比略低，這可能與香爐山雞長期閉鎖繁育有關(guān)，封閉的環(huán)境近交難以避免，可以考慮適當(dāng)引入外血進行雜交改良。

表4 香爐山雞微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性分析

本研究的香爐山雞平均觀察雜合度與平均期望雜合度分別為0.575 7、0.637 1，均大于0.5，屬于高度多態(tài)，低于鄧?yán)^賢等[17]對廣西東蘭雞的研究結(jié)果（0.668 5、0.700 4），高于張學(xué)余等[18]對7 個地方雞種的研究結(jié)果（0.512 0、0.551 0），整體來說香爐山雞群體內(nèi)雜合子比例比較多，具有豐富的遺傳變異，可以嘗試加強對該雞種的選育力度。

4 結(jié) 論

本研究通過21 個微衛(wèi)星標(biāo)記對121 只香爐山雞遺傳多樣性進行分析，得出香爐山雞平均多態(tài)信息含量為0.580 7，處于高度多態(tài)，具有豐富的遺傳多樣性，可以作為改良其他品種的外血種質(zhì)資源；平均觀察雜合度為0.575 7，平均期望雜合度為0.637 1，均大于0.5，群體中雜合子比例比較大，整齊度不高。本研究結(jié)果可以為香爐山雞的選育提供參考。