樊慶燦

（宜春學院生命科學與資源環(huán)境學院，江西宜春 336000）

動物皮膚在體溫調節(jié)、保護、感覺、偽裝和交配中發(fā)揮重要作用，這些功能是通過皮膚及其衍生物特有的生理結構完成的。動物發(fā)育過程中外胚層表皮與中胚層真皮相互作用，分化成多種多樣的皮膚和衍生物[1]。在皮膚發(fā)育的研究中，雞是一種理想模型，這是由于雞軀體被覆羽毛，脛部含有鱗片狀皮膚表面，代表了比較典型的皮膚結構，對其發(fā)育調節(jié)的研究有助于促進對人類皮膚發(fā)育機理的研究。在禽類皮膚研究中，發(fā)現(xiàn)多個基因參與皮膚發(fā)育過程，如成纖維細胞生長因子10（Fibroblast Growth Factor 10，F(xiàn)GF10）的表達促進羽芽發(fā)育[2]，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bone Morphogenetic Protein 2，BMP2）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（Bone Morphogenetic Protein 4，BMP4）可以通過抑制羽芽發(fā)育調節(jié)羽徑大小[3]，德爾塔1 基因（Delta1，DELTA1）誘導鱗片皮膚發(fā)育[4]，BMP 受體蛋白等則將鱗片轉化為羽毛[5]，Wnt 信號通路參與了整個皮膚形態(tài)發(fā)生過程[6]等。雞發(fā)育初期的皮膚上皮（7 d 羽毛皮膚和9 d 鱗片皮膚）具有高度可塑性，蘊含分化為羽毛或鱗片的潛能[7]，決定早期胚胎羽毛和鱗片皮膚的命運。本研究利用雞胚表達譜數(shù)據(jù)[8]，結合生物信息技術，篩選影響雞胚胎羽毛和鱗片皮膚發(fā)育的調控通路和相關基因。本研究成果將有利于人類皮膚發(fā)育機理的研究。

1 材料方法

1.1 數(shù)據(jù)采集 本研究表達譜數(shù)據(jù)來自基因表達數(shù)據(jù)庫，編號為GSE62882（https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi），樣品信息見表1，包括白來航雞7日齡胚胎背側皮膚上皮樣品（FE7）2 個、背側皮膚間充質（FM7）樣品2 個，9 日齡胚胎背部皮膚上皮（FE9）樣品3 個、背部皮膚間充質（FE9）3 個，9 日齡胚胎跖皮膚上皮樣品（SE9）2 個、跖皮膚間充質（SM9）2個，11 日齡胚胎跖皮膚上皮（SE11）3 個、跖皮膚間充質（SM11）3 個，共20 樣品，采用Affymetrix Chicken Genome Array（GPL3213）進行表達譜測序，獲得20個樣品33 457 個轉錄本的數(shù)據(jù)[8]。

1.2 統(tǒng)計軟件 表達譜數(shù)據(jù)的轉換、表達差異分析使用在線軟件GEO2R（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）。顯著基因的互作分析使用在線軟件STRING（https://string-db.org/cgi/input.pl? sessionId=NPdugdy y2MoP & InInput_page_show_ search=on），基因互作分析圖、核心基因計算作圖和GO 分析作圖均使用軟件Cytoscape 3.6.1?；蛲贩治觯↘EGG）使用在線軟 件DAVID（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp），韋恩圖解分析使用在線軟件Veen Diagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)。

表1 20 個樣本的信息統(tǒng)計表

1.3 分析方法 GEO2R 中輸入編號GSE62882，獲取20個樣本信息，進行l(wèi)og 轉化后繪制箱式圖觀察表達譜數(shù)據(jù)分布，并按照表1 將樣本定義為8 個組，按照FE7-FE9、FM7-FM9、SE9-SE11 和SM9-SM11 兩兩進行表達差異分析，并分別命名為FE7-9、FM7-9、SE9-11 和SM9-11，選擇False discovery rate（FDR）法進行P值調整（Padj），基因注釋選擇NCBI。

4 組差異基因（P<0.01）分別輸入到Venn diagram中進行韋恩圖解分析，獲得差異分析的共同基因。使用String 對4 組顯著基因（P<0.01）進行基因互作分析，根據(jù)參與互作網(wǎng)絡的基因數(shù)目的差異，確定最低綜合得分值，導出4 組分析差異基因的互作網(wǎng)絡數(shù)據(jù)，并導入Cytoskype 中作圖，刪除位于互作圖邊緣地帶的基因。核心基因的計算使用cytoHubb 插件的Betweenness 算法，并對核心基因進行合并分析。差異基因（P<0.01）的GO 分析采用Cytoskype 軟件中的BINGO 插件，KEGG 分析使用在線軟件DAVID。

2 結果

2.1 數(shù)據(jù)標準化和箱式圖 如圖1 所示，樣本的下、上邊緣值分別為（2.43±0.03）和（13.39±0.33），下、上四分之一值分別為（4.15±0.07）和（7.85±0.09），中位數(shù)為（5.65±0.02），說明20 個樣本表達量數(shù)據(jù)比較一致，可以進行轉錄本的差異分析。

圖1 20 個樣本表達量數(shù)據(jù)標準化后的統(tǒng)計信息

2.2 基因表達差異分析 由表2 可知，F(xiàn)E7-9 篩選出28個Padj<0.05 和590 個P<0.01 的基因，9 日齡與7 日齡相比，191 個基因（P<0.01）上調，399 個基因（P<0.01）下調，上調基因細胞基質蛋白（Periostin,POSTN）是Padj最小且差異倍數(shù)最大的基因。FM7-9 篩選出1 個Padj<0.05和473 個P<0.01 的基因，其中185 個基因（P<0.01）上調，288 個基因（P<0.01）下調，上調基因海綿糖基因（Spondin 2,SPON2）的差異倍數(shù)最大。SE9-11 篩選出116 個Padj<0.05 和795 個P<0.01 的基因，11 日齡與9 日齡相比，上調基因（P<0.01）292 個，下調基因（P<0.01）503 個，其中下調基因絲氨酸/蘇氨酸激酶基因（Serine/Threonine Kinase 32B,STK32B）的Padj最小且差異倍數(shù)最大。SM9-11 篩選出0 個Padj<0.05 和73個P<0.01 的基因，45 個基因（P<0.01）上調（P<0.01），28 個基因（P<0.01）下調，其中上調基因角蛋白5 基因（Keratin 5，KRT5）的差異倍數(shù)最大。

4 組差異基因（P<0.01）韋恩圖解分析結果如圖2 所示，脂肪酸結合蛋白（Fatty Acid Binding Protein7，F(xiàn)ABP7）在4 組差異分析中均為差異基因（P<0.01），F(xiàn)E7-9、FM7-9 和SE9-11 有27 個共同基因。FE7-9 和SE9-11含有184 個共同基因（FE-SE）。對FE7-9、FM7-9、SE9-11、SM9-11 和FE-SE 的基因進行核心基因分析并合并作圖（圖3），可見核心基因組成一個較大的互作網(wǎng)絡，并通過關鍵基因纖維連接蛋白1（Fibronectin1，F(xiàn)N1）和血小板源性生長因子（Platelet Derived Growth Factor Subunit B，PDFGB）連接在一起。

表2 差異表達分析篩選的顯著基因信息

圖2 4 組差異表達基因的韋恩圖解分析

圖3 4 組差異分析的核心基因合并后的互作圖

2.3 差異基因的GO 分析 如圖4 所示，F(xiàn)E7-9、FM7-9、SE9-11 和SM9-11 分別富集到21、8、20 個和0 個顯著的條目（P<0.01），F(xiàn)E7-9、FM7-9 和SE9-11 篩選到3 個顯著基因最多的共同GO 條目，從上到下分別為多細胞組織過程（0032501）、發(fā)育過程（0032502）和單細胞組織發(fā)育（0007275），這3 個條目在FM7-9 和SE9-11 的GO 分析中P值最小。關鍵核心基因PDFGB和基因POSTN存在于上述所有GO 條目中。FE7-9 中P值最小的GO 條目為生物黏附（0022610）和細胞黏附（0007155），關鍵的核心基因FN1和基因POSTN屬于該條目。

2.4 差異基因的信號通路分析 如圖5 所示，4 組差異基因分別篩選出5、7、10、2 條調節(jié)通路。FE7-9、FM7-9、SE9-11 中篩選的P值最小的信號通路分別為氮代謝（00910）、MAPK 信號通路（04010）和Wnt 信號通路（04310）。黏附斑激酶信號通路（04510）是SM9-11 通路分析中發(fā)現(xiàn)的P值最小的通路，也是4 組差異分析中篩選到的共同通路，F(xiàn)E7-9、FM7-9、SE9-11 和SM9-11 的差異基因中分別有12、10、17、4 個基因參與了此通路，F(xiàn)N1和PDGFB等5 個核心基因參與了此通路。

3 討 論

3.1 差異表達基因分析 本研究篩選了雞胚胎皮膚上皮和間充質組織的差異表達基因，羽毛和鱗片上皮組織中共篩選到144 個差異基因（Padj<0.05），間充質組織中只篩選到1 個差異表達基因（Padj<0.05），說明胚胎發(fā)育初期（7～11 d）的皮膚上皮比間充質更為活躍。9 胚齡與7 胚齡相比，背部羽毛上皮下調的基因數(shù)遠遠高于上調的基因數(shù)，11 胚齡與9 胚齡相比，鱗片上皮下調的基因數(shù)遠遠高于上調的基因數(shù)，可能是羽毛皮膚（9 d）、鱗片皮膚（11 d）已經歷了細胞的發(fā)育高峰，胚胎發(fā)育初期的羽毛皮膚（7 d）和鱗片皮膚（9 d）是皮膚發(fā)育的關鍵時期[9]。韋恩圖解分析中，F(xiàn)E7-9 與SE7-9 有較多的共同基因，羽毛皮膚和鱗片皮膚的發(fā)育過程具有很多的相似性。

3.2 差異基因的GO 分析 4 組差異表達基因的GO 分析中，篩選出3 條相同的GO 條目，下級條目單細胞組織發(fā)育指多細胞有機體從最初的狀態(tài)（如合子）發(fā)展到后來狀態(tài)的生物過程，包括胚胎分化和生長的整個過程。本研究差異基因的GO 分析富集在單細胞發(fā)育及相關條目基因數(shù)最多，因為皮膚發(fā)育是胚胎發(fā)育的一部分，出現(xiàn)這種結果也是必然的。FE7-9 富集在細胞黏附基因數(shù)均28 個。7～9 日齡胚胎是皮膚分化發(fā)育關鍵時期，本研究篩選到28 個黏附相關基因。在胚胎發(fā)育過程中，細胞與細胞、細胞和基質之間的黏附和定向細胞移動，是細胞分化和發(fā)育成特定組織器官的基礎，在整個過程中，黏附分子發(fā)揮著重要作用[9]，其廣泛參與了雞胚胎皮膚細胞的分化發(fā)育。這與本研究的結果一致。

圖4 差異表達基因GO 樹狀分析圖

圖5 差異表達基因KEGG 分析的顯著通路

3.3 FAK 信號通路和關鍵基因 KEGG 分析中篩選出的共同信號通路是FAK 信號通路。FAK 通路參與調節(jié)細胞生長、凋亡、黏附和遷移等各細胞過程[10]，并通過調節(jié)金屬蛋白酶-9（Matrix Metallo Proteinase 9，MMP-9）活性導致細胞外基質的降解，調控細胞粘附性[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞黏附在禽類羽毛圖案的形成中起著中心作用[14]，細胞黏附活動不僅促進細胞聚集形成真皮[15]，穩(wěn)定的細胞聚集體還能啟動表皮板的形成[16]。本研究篩選出的基因中，PDFGB、FN1和POSTN都是FAK 信號通路相關的基因。PDFGB能刺激細胞合成大量特定的細胞外基質，引起細胞增殖、遷移和分化[17-18]，其異常表達導致皮膚纖維瘤的發(fā)生[19-20]。FN1通過結構域與細胞表面受體、纖維蛋白等特異性結合，調控細胞的遷移、分化和黏附[21]，參與胚胎細胞分化和器官形成[22]。POSTN參與細胞的募集和黏附，調節(jié)胚胎發(fā)育[23]，并通過結合整合素類蛋白來激活FAK 信號途徑發(fā)揮調節(jié)作用[24]。

目前禽類皮膚發(fā)育的研究較少，相關基因及調節(jié)機理并不完全清楚。本研究發(fā)現(xiàn)的黏附斑信號通路具有廣泛的生物功能，但其對禽類皮膚發(fā)育的調節(jié)作用未見報道。3 個關鍵基因PDFGB、FN1和POSTN與FAK 信號通路有關，并在細胞黏附和胚胎發(fā)育中具有重要的調節(jié)作用。正如前人所言，細胞黏附活動是細胞分化和發(fā)育成特定組織器官的基礎[9]，F(xiàn)AK 信號通路介導的細胞黏附活動是禽類胚胎皮膚發(fā)育研究的重要方向。

4 結 論

本研究利用數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)和生物信息技術，篩選影響雞胚胎皮膚發(fā)育的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育早期（7 d羽毛皮膚和9 d 鱗片上皮）是皮膚發(fā)育的關鍵時期。篩選的基因中與單細胞組織發(fā)育相關的基因最多，羽毛上皮（7 d、9 d）部分差異基因富集在細胞黏附。FAK 信號通路介導的細胞黏附活動可能參與雞胚胎皮膚的整個發(fā)育過程，關鍵基因PDGFB、FN1和POSTN是值得關注的候選基因。