楊丕才 ，劉 珂，曹海月，劉虹華，溫婭婭，毛海光，尹兆正*

(1.云南省景東彝族自治縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南景東 676200；2.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058)

磷脂酰肌醇-4-磷酸3-激酶催化亞基2 型α（PIK3C2A）屬于磷脂酰肌醇3 激酶（PI3Ks）家族，該家族是一類參與肌醇磷酸化的激酶，共三類亞型，可由生長(zhǎng)因子、激素和細(xì)胞因子激活，進(jìn)而控制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和代謝[1-2]。PIK3C2A是PI3Ks 家族Ⅱ類成員之一，參與磷脂酰肌醇（PI）的磷酸化，對(duì)生長(zhǎng)和骨骼形成起關(guān)鍵作用[3]。同時(shí)，PIK3C2A也是哺乳動(dòng)物PI3K/Akt 通路的關(guān)鍵基因之一，通過抑制TSC2 蛋白活化雷帕霉素靶蛋白（mTOR），促進(jìn)細(xì)胞體積增長(zhǎng)和數(shù)目增加，與肌肉質(zhì)量和強(qiáng)度顯著相關(guān)[4]。史新娥等[5-8]研究表明，阻斷PI3K 信號(hào)通路可磷酸化激活FoxO1，從而抑制骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化。

體尺和屠體性狀是衡量家禽生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)效益的重要指標(biāo)之一，同時(shí)，也對(duì)家禽品種的鑒定和改良具有重要參考意義[9]。本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)在前期通過GWAS 初步篩選出了與寧海黃雞和廣西黃雞屠體性狀相關(guān)的候選基因PIK3C2A[10]，后期通過600K 基因芯片對(duì)寧海黃雞和廣西黃雞PIK3C2A基因多態(tài)性及其與屠體性狀之間的相關(guān)性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在PIK3C2A基因內(nèi)含子區(qū)域的38 個(gè)SNPs 中，寧海黃雞的7 個(gè)SNPs 和廣西黃雞的6 個(gè)SNPs 分別與部分屠體性狀顯著相關(guān)（P<0.05 或P<0.01）（未發(fā)表）。鑒于PIK3C2A基因在生長(zhǎng)和骨骼形成方面具有重要的功能，在雞中開展對(duì)該基因多態(tài)性的相關(guān)研究就顯得尤為重要。因此，本研究以無量山烏骨雞為研究對(duì)象，探究PIK3C2A基因多態(tài)性與無量山烏骨雞體尺和屠體性狀的相關(guān)性，以期為無量山烏骨雞的分子標(biāo)記選育工作提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和方法 本實(shí)驗(yàn)所用300 日齡無量山烏骨雞由景東縣龍街無量山烏骨雞養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供。分兩批進(jìn)行采樣，共192 只?，F(xiàn)場(chǎng)屠宰，頸部取血，血液用EDTA 抗凝，-20℃保存。

1.2 血液DNA 的提取 依據(jù)說明，使用TIANGEN 血液基因組DNA 提取試劑盒（天根，北京）提取基因組DNA，并采用NanoDrop2000 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣本的濃度及OD 值，A260/A280在1.8～2.1 范圍內(nèi)的DNA 用于后續(xù)基因測(cè)序及多態(tài)性研究。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 性狀測(cè)定 按照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《肉雞生產(chǎn)性能測(cè)定技術(shù)規(guī)范》(NY/T 828-2004) 進(jìn)行體尺和屠體性狀的測(cè)定。體尺性狀包括：體斜長(zhǎng)、胸寬、胸深、胸角、龍骨長(zhǎng)、骨盆寬、脛長(zhǎng)和脛圍。實(shí)驗(yàn)雞經(jīng)活重和體尺測(cè)定后，立即進(jìn)行屠宰測(cè)定。測(cè)定項(xiàng)目包括屠體重、半凈膛重、全凈膛重、胸肌重和腹脂重，并對(duì)屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率和腹脂率進(jìn)行計(jì)算。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 上提供的雞PIK3C2A基因序列（NC_006092.5），用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，引物序列為F：GGAGAACAGCAAGTGCCAGGAC；R：CACACGCCAAAACACCAGCC，退火溫度為53℃。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系為50 μL：DNA 模板（50 ng/μL）2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，Taq Master Mix 25 μL，dd H2O 補(bǔ)至50 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，循環(huán)數(shù)為35；72℃延伸10 min。擴(kuò)增后用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。

1.3.4 測(cè)序和分型 擴(kuò)增產(chǎn)物由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司采用直接測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用DNAStar 等生物學(xué)軟件進(jìn)行序列比對(duì)，篩選SNPs，分析測(cè)序峰圖，完成分型。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 利用Excel 計(jì)算各突變位點(diǎn)基因頻率和基因型頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne），并進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，采用SPSS21.0 一般線性模型（GLM）程序?qū)Ω鱾€(gè)突變位點(diǎn)與雞體尺和屠體性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。使用最小二乘方差分析模型如下：

其中，Yijk為性狀觀察值；μ為群體均值；Gi為基因型效應(yīng)；Bj為批次效應(yīng)；ek為隨機(jī)誤差。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示，以P<0.05 為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 基因型頻率、基因頻率及群體遺傳特性分析 測(cè)序結(jié)果顯示，雞PIK3C2A基因第6 內(nèi)含子上共檢測(cè)到5 個(gè)突變位點(diǎn)，分別為：g.38511T>A、g.38573C>T、g.38632T>C、g.38662A>G 和g.38729C>T。各突變位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率見表1。由表1 可知，各個(gè)突變位點(diǎn)均有3 種基因型。g.38511T>A 位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為AA，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳；g.38573C>T 位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因型為CC，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镃；g.38632T>C 位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因型為TT，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)門；g.38662A>G 優(yōu)勢(shì)基因型為AG，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳；g.38729C>T 位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因型為CT，優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镃。卡方檢驗(yàn)顯示，各個(gè)位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)（P>0.05）。各位點(diǎn)的PIC 都處于0.25～0.50 之間，屬于中度多態(tài)。各位點(diǎn)雜合度低，且有效等位基因數(shù)接近2，可見在該群體中等位基因分布較均勻。

2.2PIK3C2A基因多態(tài)性與體尺性狀關(guān)聯(lián)分析PIK3C2A基因5 個(gè)SNPs 位點(diǎn)與無量山烏骨雞體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表2。由表2 可知，在g.38511T>A 位點(diǎn)，TT基因型個(gè)體的龍骨長(zhǎng)高于AA 型個(gè)體（P<0.05），TT基因型個(gè)體胸角高于TA 基因型個(gè)體（P<0.01），且TT 基因型個(gè)體的脛圍高于TA 基因型個(gè)體（P<0.05）。在g.38573C>T 位點(diǎn)，CC 基因型個(gè)體的胸角和脛圍都高于CT 基因型個(gè)體（P<0.05），但TT 基因型的盆骨寬高于CC 和CT 基因型個(gè)體（P<0.05）。在g.38632T>C位點(diǎn)，CC 基因型個(gè)體的胸角和脛圍都高于TT 和TC 基因型個(gè)體（P<0.05）。在g.38662A>G 位點(diǎn)，GG 基因型個(gè)體的胸角高于AG 和AA 基因型個(gè)體（P<0.05），且GG 基因型個(gè)體的脛圍高于AG 基因型個(gè)體（P<0.05）。在g.38729C>T 位點(diǎn)，TT 基因型個(gè)體的胸角高于CC型個(gè)體（P<0.05）和CT 基因型個(gè)體（P<0.01），且TT 基因型個(gè)體的盆骨寬高于CC 和CT 基因型個(gè)體（P<0.05）。各個(gè)突變位點(diǎn)與烏骨雞體斜長(zhǎng)、胸深和龍骨長(zhǎng)均無相關(guān)性（P>0.05）。

2.3 多態(tài)性位點(diǎn)與屠體性狀關(guān)聯(lián)分析 由表3 可知，PIK3C2A基因g.38511T>A 位點(diǎn)的多態(tài)性與屠體率相關(guān)（P<0.05），其中AA 型個(gè)體的屠體率高于TA 型個(gè)體（P<0.05）。在g.38573C>T 位點(diǎn)，多態(tài)性與烏骨雞屠體性狀無相關(guān)性（P>0.05）。在g.38632T>C 位點(diǎn)，CC型個(gè)體的活重、屠體重、半凈膛重和全凈膛重均高于TC 型個(gè)體（P<0.05），而屠體率高于TC 型個(gè)體（P<0.01），且屠宰率、腹脂重和腹脂率高于TT 型（P<0.05）。在g.38662A>G 位點(diǎn)，GG 基因型個(gè)體的活重、屠體重、半凈膛重和全凈膛重高于AG 基因型個(gè)體（P<0.05），且屠體重、半凈膛重、腹脂重和腹脂率高于AA 基因型個(gè)體（P<0.05），但AA 基因型個(gè)體的胸肌率高于GG基因型個(gè)體（P<0.05）。在g.38729C>T 位點(diǎn)，TT 基因型個(gè)體的活重、屠體重和半凈膛重均高于CT 基因型個(gè)體（P<0.01），且全凈膛重高于CT 基因型（P<0.05），但胸肌率低于CC 基因型個(gè)體（P<0.05）。

3 討 論

3.1 基因型頻率、基因頻率及群體遺傳特性分析 近些年來，關(guān)于雞基因鑒定及其與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)的研究越來越多。在畜禽分子育種中候選基因法是當(dāng)前育種工作者常采用的手段之一，通過分子標(biāo)記篩選，家禽主要經(jīng)濟(jì)性狀得到了很大的改善[11-14]。PIK3C2A基因多態(tài)性與雞體尺和屠體性狀的相關(guān)性研究甚少，本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)在前期采用600KSNP 芯片分析了寧海黃雞和廣西黃雞兩個(gè)國(guó)內(nèi)優(yōu)質(zhì)地方雞種PIK3C2A基因多態(tài)性及其與屠體性狀之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)含子區(qū)域有與屠體性狀顯著相關(guān)的SNPs（未發(fā)表）。因此，該實(shí)驗(yàn)通過分析無量山烏骨雞PIK3C2A基因內(nèi)含子的多態(tài)性，試圖發(fā)現(xiàn)其與雞體尺和屠體性狀的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)在無量山烏骨雞PIK3C2A基因第6 內(nèi)含子處共檢測(cè)到5 個(gè)突變位點(diǎn)，均處于中度多態(tài)（0.25

表1 基因型頻率和等位基因頻率及群體遺傳特性

表2 PIK3C2A 基因SNPs 與無量山烏骨雞體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析

表3 PIK3C2A 基因第6 內(nèi)含子SNPs 與無量山烏骨雞屠體性狀的關(guān)聯(lián)分析

3.2PIK3C2A基因多態(tài)性與雞體尺性狀的相關(guān)性 有研究表明，PI3K 信號(hào)通路可以激活絲氨酸/ 蘇氨酸激酶AKT1、AKT2和AKT3。其中AKT1是與生長(zhǎng)相關(guān)的基因；AKT2在骨骼肌、肝臟和脂肪等組織高表達(dá)[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt 信號(hào)通路對(duì)胚胎雞成肌細(xì)胞增殖和骨骼肌生長(zhǎng)有重要意義[17]。因此推斷，PIK3C2A基因多態(tài)性可能與體尺性狀有相關(guān)性。王利娜[18]等人研究發(fā)現(xiàn)，PIK3CA基因的c.3068 A>G 與歐洲大白兔和福建黑兔生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)。目前，有關(guān)雞PIK3C2A基因的多態(tài)性與體尺性狀的研究還尚未報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)首次探究了無量山烏骨雞PIK3C2A基因的多態(tài)性與體尺性狀的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示，5 個(gè)突變位點(diǎn)均與體尺性狀有相關(guān)性（P<0.05）。此外，在g.38662A>G 和g.38729C>T 位點(diǎn)，突變后的基因型個(gè)體的胸角和脛圍均高于未發(fā)生突變的基因型個(gè)體（P<0.05）。因此，可初步認(rèn)為PIK3C2A基因多態(tài)性與雞體尺性狀具有相關(guān)性。

3.3PIK3C2A基因多態(tài)性與雞屠體性狀的相關(guān)性 家禽的屠體性狀也是重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一，屠宰率和全凈膛率是衡量家禽產(chǎn)肉性能的主要標(biāo)志[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在g.38632T>C 位點(diǎn)，CC 基因型個(gè)體的活重、屠體重、半凈膛重和全凈膛重均顯著高于TT 和TC 基因型個(gè)體（P<0.05），但TT 基因型的腹脂重和腹脂率較低，這可能是與PI3K 信號(hào)通路激活的AKT2在脂肪組織中高表達(dá)有關(guān)[20-21]。該基因與腹脂性狀密切相關(guān)，可能與雞腹脂性狀的主效基因或與控制該性狀的主效基因連鎖。在g.38729C>T 位點(diǎn)，TT 基因型個(gè)體的活重、屠體重和半凈膛重均極顯著高于CT 基因型個(gè)體（P<0.01），且具有較高的全凈膛重，但胸肌率顯著低于CC 基因型個(gè)體（P<0.05）。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推斷g.38632T>C和g.38729C>T 這2 個(gè)位點(diǎn)可能是影響無量山烏骨雞屠體性狀的關(guān)鍵位點(diǎn)。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在無量山烏骨雞PIK3C2A基因第6 內(nèi)含子處共檢測(cè)到5 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。對(duì)各多態(tài)位點(diǎn)與體尺性狀和屠體性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，在體尺性狀上，5 個(gè)位點(diǎn)均與體尺性狀具有相關(guān)性；在屠體性狀上，除g.38573C>T 位點(diǎn)與屠體性狀無顯著相關(guān)性外，其余各位點(diǎn)均與屠體性狀相關(guān)（P<0.05 或P<0.01）。由此推測(cè)，PIK3C2A基因可作為雞體尺性狀和屠體性狀的分子標(biāo)記輔助選擇的候選基因。