金太花,婁安鋼,季久秀,李鐘淑,關(guān)立增*
(1.臨沂大學農(nóng)林科學學院,山東臨沂 276005;2.延邊大學農(nóng)學院,吉林延吉 133002)
長白山野豬作為我國特有的豬種資源,具有瘦肉率高、不飽和脂肪酸含量高和抗病力強等特性,但野豬肉具有肉質(zhì)堅硬、土腥味大等缺點[1-2]。東北民豬雖然具有生長速度快的優(yōu)勢,但其瘦肉率和不飽和脂肪酸含量低等肉質(zhì)缺點已不能滿足消費者日益增長的需求[3]。因此,利用長白山野豬與東北民豬雜交制備長白山野雜豬正成為改良家豬生產(chǎn)性能與肉品質(zhì)的主要方法之一。長白山野雜豬具有肉質(zhì)柔軟鮮嫩、纖維較細、肉色好、脂肪入口即化等特點,也克服了野豬肉質(zhì)堅硬、土腥味大的特性與家豬肉中亞油酸含量低等弊端[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),長白山野雜豬肉中的不飽和脂肪酸(C14:1、C16:1、C18:1T、C18:1C、C20:1N9)含量顯著高于東北民豬[4]。但關(guān)于長白山野雜豬與東北民豬肉質(zhì)性狀差異形成的分子機理還不清楚,有待進一步研究。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展,與肉質(zhì)性狀相關(guān)的基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn),這對動物肉質(zhì)性狀的研究起到了巨大推動作用,其中在轉(zhuǎn)錄組水平上對影響肉質(zhì)性狀基因的研究,可揭示影響肉質(zhì)性狀的分子機理[5-7]。目前關(guān)于豬肉質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄組的研究已有一定進展。如Wu 等[8]在分析金華豬和長白豬背最長肌的全基因表達譜時發(fā)現(xiàn),金華豬中與脂肪酸生物合成調(diào)節(jié)有關(guān)的基因表達水平高于長白豬。Yu 等[9]對藍塘豬和長白豬背最長肌中與脂肪酸組成有關(guān)的候選基因進行研究發(fā)現(xiàn),在2 個豬種之間差異表達的基因有586 個,其中在藍塘豬中高表達的基因有267個,13 個基因被確定為肌肉脂肪酸組成的候選基因。Corominas 等[10]分析了長白豬×伊比利亞豬雜交豬與長白豬回交豬的背部肌內(nèi)脂肪酸的組成,結(jié)果顯示,在2 個豬種之間共篩選到的候選基因有396 個,其中在高肌內(nèi)飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸群體中有247 個基因表達較高,而在高多不飽和脂肪酸群體中有149 個基因表達較高。Anna 等[11]對伊比利亞豬與長白豬回交所得到豬中有極端表型群體的背最長肌的轉(zhuǎn)錄組進行分析發(fā)現(xiàn),與肌內(nèi)脂肪沉積有關(guān)的差異基因有18 個。而目前關(guān)于長白山野雜豬與東北民豬背最長肌基因的mRNA轉(zhuǎn)錄組分析還未見報道,有待進一步研究。本研究將通過RNA-Seq 技術(shù)對長白山野雜豬與東北民豬背最長肌基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄組差異進行分析,為揭示長白山野雜豬與東北民豬的肉質(zhì)性狀差異機理提供理論依據(jù)。
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗動物 3 頭F1代長白山野雜豬和3 頭東北民豬,其中F1代雜交豬是由長白山野豬和東北民豬雜交得到(野豬♂× 東北民豬♀),3 頭長白山野雜豬均為同父;3 頭東北民豬為同母。所有實驗豬均飼養(yǎng)于延邊金村長野生動物養(yǎng)殖專業(yè)農(nóng)場。生長前期圈養(yǎng),每日飼喂3 次,生長后期放養(yǎng),每日飼喂2 次,自由采食,自由飲水。實驗期間按照特種野豬場正常的免疫程序進行免疫,分別飼喂至120 kg 左右進行屠宰。
1.1.2 采樣 宰前將長白山野雜豬和東北民豬趕入待宰圈,禁食不禁水24 h。電麻后倒掛放血、褪毛,屠宰后,取左半胴體背最長肌并分割成0.5 cm3左右小組織塊裝入凍存管,立即放于液氮中,用于RNA-seq 分析。
1.1.3 試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa);RNA Extraction Kits 試劑盒、RNA-seq 試劑盒購自美國Illumina 公司。
1.2 背最長肌總RNA 的提取 背最長肌組織中的RNA提取主要按ExRNA Extraction Kits 試劑盒步驟進行。
1.3 mRNA 的高通量測序
1.3.1 cDNA 文庫的構(gòu)建 根據(jù)RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行總RNA 的反轉(zhuǎn)錄,通過兩步法進行cDNA 雙鏈的合成并進行純化,將純化的cDNA 進行末端修復后依次進行末端dA 加尾和接頭連接反應,然后進行連接產(chǎn)物的純化,將純化的連接產(chǎn)物進行PCR 擴增,獲得cDNA 文庫,最后將獲得的cDNA 文庫通過LC 公司的Illumina 測序平臺完成mRNA 高通量測序。
1.3.2 cDNA 文庫的RNA-seq 測序與質(zhì)量控制 通過Illumina 公司的High-seq 測序平臺分別對獲得的上述樣品進行雙末端測序。測序流程為:總RNA →利用Oligo(dT)富集mRNA 和去除rRNA 富集mRNA →mRNA 打斷成200 nt →隨機引物六聚體合成cDNA →末端修復、加dA 和加接頭后PCR 擴增→Illumina 測序。將測序得到的原始序列(raw reads)中帶有接頭的、含有poly-N 和低質(zhì)量的序列去掉,以便獲得干凈序列(clean reads)。最后用Q20 與Q30 方法分析堿基測序錯誤率,以此來分析測序質(zhì)量的高低。
1.3.3 測序序列比對分析與表達水平確定 利用TopHat和Bowtie 軟件參照豬基因組序列對長白山野雜豬和東北民豬背最長肌組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比對與注釋。采用 HTSeq0.5.3 軟件計算比對到基因組上轉(zhuǎn)錄本的序列(reads) 數(shù),確定基因的轉(zhuǎn)錄水平。
1.3.4 差異表達轉(zhuǎn)錄本的鑒定 本研究利用DEGSeq R package v1.10.1 系統(tǒng)對長白山野雜豬與東北民豬之間的差異表達基因進行分析。利用Cufflinks vl.3.0 程序包對來自于TopHat 的數(shù)據(jù)的己知轉(zhuǎn)錄本及新轉(zhuǎn)錄本進行分析。
1.3.5 GO 和KEGG 富集分析 利用GOseq R 軟件包對差異基因進行GO 富集分析。利用KOBAS 軟件對差異基因進行信號通路富集分析。
1.4 數(shù)據(jù)分析 結(jié)果以平均值±標準差表示;采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)方法對長白山野雜豬和東北民豬之間的差異表達 mRNA 進行分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01 表示差異極顯著。
2.1 原始序列數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制 分析顯示,長白山野雜豬與東北民豬的Q20 值都達到96% 以上,Q30 值都達到91% 以上。隨后對測序錯誤率分布和GC 含量分布進行了檢測,結(jié)果顯示,測序過程中堿基錯誤率均低于0.5%,說明測序質(zhì)量較高。通過過濾得到的干凈序列在長白山野雜豬與東北民豬2 個文庫數(shù)據(jù)量均大于20 G,說明獲得的干凈序列可用于隨后的轉(zhuǎn)錄組分析。
2.2 測序序列比對 將過濾后得到的干凈序列采用Tophat 軟件進行序列比對分析,結(jié)果顯示,在長白山野雜豬與東北民豬中均有100% 以上的序列能完全比對到豬基因組上,而所轉(zhuǎn)錄的基因占總基因的比例在3 頭長白山野雜豬中平均為59.67%(分別是58.88%、59.37%、60.75%),在3 頭東北民豬為58.73%(分別是57.88%、58.80%、59.51%),而在不同個體間SNP位點數(shù)達到14 299~19 671。
2.3 轉(zhuǎn)錄本表達水平分析 分析顯示,在長白山野雜豬與東北民豬2 個品種中共有17 171 個基因表達,東北民豬中有16 552 個基因表達,長白山野雜豬中有16 461 個基因表達。其中有15 842 個基因在長白山野雜豬與東北民豬中進行了共表達(圖1)。其中在東北民豬中特異表達的基因有710 個,在長白山野雜豬中特異表達的基因有619 個。對長白山野雜豬與東北民豬中的基因數(shù)目進行分析發(fā)現(xiàn),在2 個品種豬中約有15% 的基因為高豐度表達;約有25% 的基因為中豐度表達;約55%的基因為低豐度表達。
2.4 差異表達基因分析 分析顯示,在長白山野雜豬與東北民豬背最長肌中一共檢測到153個顯著差異表達基因,其中在長白山野雜豬與東北民豬中顯著高豐度差異表達的前10 個基因中,PDLIM3(ENSSSCG00000015796)基因在長白山野雜豬和東北民豬中的豐度均為最高(圖1、圖2)。相對于東北民豬,在長白山野雜豬中有55個為上調(diào)表達基因,98 個為下調(diào)表達基因。表1 分別列出了前10 個顯著差異表達的上調(diào)及下調(diào)基因,其中一些基因與肉品質(zhì)有密切關(guān)系,如SCD 基因與機體內(nèi)不飽和脂肪酸生成有關(guān)。
圖1 長白山野雜豬與東北民豬2 個豬種中差異表達基因散點圖
圖2 在長白山野雜豬與東北民豬中高豐度表達的前10 個差異表達基因
2.5 差異表達基因的GO 分析 分析發(fā)現(xiàn),在長白山野雜豬與東北民豬背最長肌中,153 個差異表達基因被注釋到了33 條GO 條目中。其中注釋到生物學過程中的有11 條,注釋到細胞組分的有11 條,注釋到分子功能中的有11 條(圖3)。
2.6 差異基因的KEGG 分析 分析顯示,153 個差異表達基因與130 條通路有關(guān),每條通路中含有從1 到10 不等的差異基因,本文列出了富集程度排名前20 的pathway 條目(圖4)。
相對于傳統(tǒng)芯片技術(shù)而言,RNA-seq 測序可快速獲得某一組織細胞幾乎所有的轉(zhuǎn)錄本,不需要探針的預先設(shè)計,因此對任何物種及任何細胞來源的轉(zhuǎn)錄組都可進行檢測[12-14],具有更精確的數(shù)字化信號、檢測通量高以及檢測范圍更廣等優(yōu)點[15-17]。該技術(shù)還可對未知轉(zhuǎn)錄本及稀有轉(zhuǎn)錄本進行測序分析,因而是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復雜性的強有力的工具[18-19]。本研究采用RNA-seq測序技術(shù)對長白山野雜豬與東北民豬的背最長肌的轉(zhuǎn)錄組進行了研究,結(jié)果顯示,一些顯著生物通路和生物過程中(如脂肪代謝)的差異基因在長白山野雜豬和東北民豬中表達差異較大,初步證明了這些差異基因可能與長白山野雜豬和東北民豬背最長肌肉質(zhì)性狀的差異有關(guān)。
本研究的實驗對象為長白山野雜豬和東北民豬,雖然各品種豬外界生長環(huán)境一致,但為避免個體間差異對實驗結(jié)果造成影響,本研究對每個品種豬的3 頭豬樣本的文庫進行了分別構(gòu)建并進行單獨測序,以保證數(shù)據(jù)的獨特性,該方法相對于混合樣測定方法來說準確性更高[20]。本研究對長白山野雜豬與東北民豬的轉(zhuǎn)錄組系統(tǒng)分析結(jié)果顯示,2 個豬種之間基因表達數(shù)量存在差異,特別是不同個體間SNP 位點數(shù)達到14 299~19 671,說明在不同個體及豬種之間基因的堿基組成上存在差異。該結(jié)果進一步證明樣本的單獨測序分析法可靠性更高。
差異表達基因分析結(jié)果顯示,2 個品種豬存在著差異表達基因,如PDLIM3基因在長白山野雜豬和東北民豬中的豐度均為最高,但該基因是否與肉質(zhì)性狀差異存在密切關(guān)系還需要進一步研究。前人研究表明,肌肉中的脂肪酸含量與肉質(zhì)性狀密切相關(guān)[8-9,21]。而本研究發(fā)現(xiàn)的差異表達基因SCD與機體內(nèi)不飽和脂肪酸生成有密切關(guān)系,但長白山野雜豬和東北民豬的肉質(zhì)性狀差異是否與SCD基因調(diào)控不飽和脂肪酸含量有關(guān)還需要進一步研究。
本研究對長白山野雜豬與東北民豬背最長肌之間的差異表達基因進行了GO 功能分類和KEGG 通路富集分析,GO 分析結(jié)果顯示所有差異表達基因參與的生物學過程主要涉及有氧和活性氧代謝過程、模式分化過程和過氧化物代謝過程等;涉及的細胞組分主要有細胞頂部、MHCII 蛋白復合物等;涉及分子功能的主要有脂質(zhì)結(jié)合、維生素結(jié)合等。但這些成分中哪些與肉質(zhì)性狀相關(guān)還需要進一步分析。而KEGG 分析結(jié)果顯示,153 個差異基因參與了130 個KEGG 基因信號通路,其中一些與脂肪代謝和骨骼肌發(fā)育相關(guān)的信號通路有關(guān)。其中在差異表達基因顯著富集的通路中,發(fā)現(xiàn)了一些與調(diào)節(jié)脂類代謝顯著相關(guān)的PPAR 信號通路和Fatty acid metabolism 途徑,根據(jù)該結(jié)果推斷在長白山野雜豬與東北民豬的背最長肌中脂類代謝的差異可能是由于PPAR信號通路和Fatty acid metabolism 通路中的一些相關(guān)基因表達水平的差異引起的,這與楊建敏的研究結(jié)果相似,即PPAR 信號通路是引起槐豬杜洛克豬脂類代謝的主要通路[22]。上述分析結(jié)果為進一步篩選長白山野雜豬與東北民豬肉質(zhì)性狀差異的主效功能基因提供參考。
表1 前20 位的顯著差異表達的基因(Y/H)
圖3 差異基因的GO 分析
圖4 富集程度排名前20 的pathway 條目分析
本實驗結(jié)果顯示,在長白山野雜豬與東北民豬背最長肌中mRNA 表達存在差異,這些差異表達基因?qū)⑹菍硌芯? 個品種豬間肉質(zhì)差異的主要靶標之一。