華仁武，雷明剛,2,3*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院、動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；3.農(nóng)業(yè)部豬遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070）

外泌體是指細(xì)胞向胞外分泌并能介導(dǎo)細(xì)胞間交流的杯盤狀囊泡類小體[1-2]。最初于2006 年發(fā)現(xiàn)在女性血液中特異分離的胎盤外泌體在妊娠免疫中起重要作用[3]，于2007 年又發(fā)現(xiàn)外泌體可以攜帶生物信息（miRNA 和mRNA）來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞間的交流[4]，外泌體的功能及其在妊娠過(guò)程中發(fā)揮的作用得到了初步探索。自此之后，在人[5]、鼠[6]、牛[7]、羊[8]、豬[9]中都發(fā)現(xiàn)了外泌體與妊娠相關(guān)，來(lái)源于胚胎[10]、胎盤[11]、子宮內(nèi)膜[12]等的外泌體可以介導(dǎo)母體-胚胎交流，并在妊娠過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[13]。近年來(lái)，已經(jīng)有越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注外泌體在妊娠發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的作用及其機(jī)制。本文主要針對(duì)外泌體的特性及其在哺乳動(dòng)物妊娠過(guò)程中的功能和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行綜述，提供更加全面的視角了解妊娠生理學(xué)及其病理學(xué)。

1 外泌體

1.1 特征 外泌體是細(xì)胞向胞外分泌的囊泡類小體，直徑為20～200 nm[1-2]，具有典型的脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)，密度為1.13～1.19 g/mL，有典型的“杯盤”形態(tài)[14-15]，存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清液、血漿、血清、唾液、尿液、子宮液、羊水和惡性腹水以及其他生物體液中[16]。外泌體的功能是通過(guò)傳遞信息到其他細(xì)胞中來(lái)影響受體細(xì)胞[17]。

來(lái)源不同的外泌體有不同的結(jié)構(gòu)蛋白和脂質(zhì)并且攜帶著不同的分子貨物，最常見(jiàn)的外泌體結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)主要包括四跨膜蛋白（如CD63、CD9 和CD81）、熱休克蛋白（如Hspa8、Hsp90）、GTP 酶（如EEF1A1、EEF2）、蛋白質(zhì)標(biāo)記物（如Alix）[2]。脂質(zhì)膜是由膽固醇、甘油二酯、鞘脂、磷脂、甘油磷脂和聚甘油磷脂組成[18]。分子貨物主要包括mRNA、DNA、非編碼RNA等生物學(xué)信息[3-4,19]，其中miRNA 在對(duì)生殖軸和胚胎著床有重要影響[20]。

1.2 外泌體的釋放和吸收

1.2.1 外泌體的釋放 外泌體經(jīng)過(guò)一系列的過(guò)程從細(xì)胞內(nèi)釋放（圖1）。首先，使質(zhì)膜內(nèi)陷以形成早期內(nèi)體（Early Endosomes），其次將有效負(fù)載出芽到內(nèi)泌體膜中以形成多泡內(nèi)泌體，其中通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)所需內(nèi)體分選復(fù)合物（Endosomal Sorting Complexes Required For Transport，ESCRT）進(jìn)行分選是分子有效負(fù)載填充至多泡內(nèi)泌體的機(jī)制[21]，晚期內(nèi)體（late endosomes）通過(guò)酸化成熟，最終其成熟后與質(zhì)膜的融合釋放外泌體[15]。

1.2.2 外泌體的吸收 外泌體作用受體細(xì)胞有融合、內(nèi)吞吸收、配體-受體反應(yīng)和囊泡內(nèi)容物釋放4 種方式（圖2）[2]。

1.2.3 外泌體釋放調(diào)控 細(xì)胞受到外在刺激（如低氧、氧化應(yīng)激、剪應(yīng)力）會(huì)導(dǎo)致釋放的外泌體增加，細(xì)胞內(nèi)因子也會(huì)影響外泌體的釋放，其中包括細(xì)胞質(zhì)鈣離子的增加和細(xì)胞骨架的降解[22]。

圖1 外泌體的釋放（改編于文獻(xiàn)[16]）

圖2 外泌體的吸收（改編于文獻(xiàn)[2]）

2 外泌體對(duì)妊娠的影響

外泌體存在于人、小鼠、牛、羊、豬等哺乳動(dòng)物的子宮中。在子宮內(nèi)，外泌體主要來(lái)源于子宮、胚胎和胎盤。來(lái)源不同的外泌體在哺乳動(dòng)物的妊娠識(shí)別、胚胎附植、免疫調(diào)控、胚胎發(fā)育、分娩等過(guò)程發(fā)揮著不同的作用[13,16-17]。

2.1 外泌體對(duì)人妊娠的影響 在人上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜、早期胚胎、胎盤都可以釋放外泌體，進(jìn)而影響妊娠過(guò)程。Ng[12]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜細(xì)胞外泌體miRNA 通路富集主要和胚胎附植相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)hsa-miR-200c、hsa-miR-17 和hsa-miR-106a 在外泌體中含量最高；Vilella 等[5]實(shí)驗(yàn)證明，人子宮內(nèi)膜細(xì)胞釋放的外泌體包裹的Hsa-miR-30d 可以被小鼠胚胎吸收，能在胚胎附植期間影響胚胎的黏附。以上2 個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，子宮內(nèi)膜可以釋放包裹miRNA 的外泌體并被胚胎吸收進(jìn)而來(lái)影響胚胎附植。另外，Giacomini 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，人胚胎體外培養(yǎng)液中的外泌體可以被母體吸收，這表明胚胎外泌體也可以傳遞到母體子宮內(nèi)膜中。

就胎盤外泌體而言，Salomon 等[23]發(fā)現(xiàn)血清中胎盤外泌體在妊娠第一期（最后經(jīng)期第1 天之后第3～12 周）、第二期（第12～24 周）和第三期（第24～40 周）濃度會(huì)逐漸升高，并且能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移；Hadley 等[24]發(fā)現(xiàn)羊膜上皮細(xì)胞在氧化應(yīng)激下可以促進(jìn)外泌體的釋放，并且可以影響子宮肌層細(xì)胞和蛻膜化細(xì)胞炎癥因子分泌并激活其NFκB 通路。在妊娠中期羊水中的外泌體富含可調(diào)控免疫功能的熱休克蛋白HSC72[25]；胎盤外泌體可以調(diào)控母體免疫細(xì)胞并與免疫耐受相關(guān)[26-27]。在妊娠后期，胎盤的合體滋養(yǎng)層是外泌體的主要來(lái)源，合體滋養(yǎng)層可以釋放外泌體進(jìn)入母體血液，構(gòu)建了一個(gè)重要的胎兒和母體之間的信號(hào)傳遞機(jī)制[28]。以上研究說(shuō)明，胎盤外泌體在人妊娠過(guò)程中會(huì)不斷增加并與免疫調(diào)控和母體-胎兒的信息交流相關(guān)。

2.2 外泌體對(duì)小鼠妊娠的影響 已有研究運(yùn)用小鼠模型進(jìn)行外泌體體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)研究其在妊娠中的影響，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)體外胚胎培養(yǎng)液的外泌體可以提高小鼠的胚胎附植率，并且增加小鼠囊胚細(xì)胞增殖能力，并減少細(xì)胞凋亡[29]；Sheller-Miller 等[30]運(yùn)用小鼠模型，在小鼠妊娠16～17 d 時(shí)將熒光染色外泌體注射到子宮內(nèi)，發(fā)現(xiàn)外泌體可以被胚胎和母體吸收。該團(tuán)隊(duì)將妊娠第18 天的母體血漿外泌體腹腔注射到妊娠第15 天的小鼠中可以增加小鼠早產(chǎn)率，表明外泌體可以介導(dǎo)與分娩相關(guān)的旁分泌信號(hào)并且誘導(dǎo)分娩[31]。以上體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明外泌體在小鼠妊娠過(guò)程中可介導(dǎo)母體-胎兒的信息交流并調(diào)控其胚胎附植和分娩。

在體外實(shí)驗(yàn)上，已經(jīng)證實(shí)胚胎可以通過(guò)外泌體與母體免疫系統(tǒng)交流[32]；細(xì)胞外囊泡中的miR-21 可以對(duì)受精卵和胚胎的發(fā)育有促進(jìn)作用[33]；hnRNPC1 可以影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞釋放外泌體中的miR-30d 的含量影響胚胎附植[6]。以上體外實(shí)驗(yàn)表明外泌體可以影響鼠的免疫調(diào)控、胚胎發(fā)育和胚胎附植。

值得關(guān)注的是，Sheller-Miller 等[34]通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠等技術(shù)表明來(lái)源于母體帶有熒光標(biāo)記的外泌體可以穿過(guò)胎盤運(yùn)送至胚胎組織并使其發(fā)生改變，且外泌體在懷孕期間可作為胎兒功能的生物標(biāo)志物及藥物和其他貨物的載體，這項(xiàng)研究為體內(nèi)胚胎治療提供了一個(gè)新的有效途徑。

2.3 外泌體對(duì)牛妊娠的影響 在牛上，主要是通過(guò)提取子宮腔液和外周血外泌體進(jìn)行測(cè)序以及進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)了解其功能和調(diào)控機(jī)制。Kusama 等[35]對(duì)妊娠17、20、22 d 的牛子宮腔液外泌體做蛋白組測(cè)序，后用其處理滋養(yǎng)層CT1 和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞檢測(cè)mRNA 水平變化，發(fā)現(xiàn)外泌體處理子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞可以導(dǎo)致凋亡相關(guān)因子和黏附相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平發(fā)生變化；該團(tuán)隊(duì)還針對(duì)妊娠15、17 d 與空懷15、17 d 蛋白組測(cè)序子宮腔液外泌體發(fā)現(xiàn)CAPG、AKR1BI 和IFNT 僅在妊娠期表達(dá)，推測(cè)該蛋白是由胚胎釋放到子宮腔液中，并推斷外泌體不僅來(lái)源于子宮內(nèi)膜同時(shí)也來(lái)源于胚胎[36]。從而可以得知，在牛妊娠早期，子宮腔液包含母體和胚胎釋放的外泌體，這些外泌體能夠影響子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的mRNA 表達(dá)水平。

在外泌體調(diào)控機(jī)制的研究上，Zhao 等[7]對(duì)妊娠0 d 和60 d 的牛外周血外泌體做測(cè)序，篩選出BtamiRNA-499 在妊娠60 d 特異性高表達(dá)，它可以通過(guò)靶向Lin28B 進(jìn)而調(diào)控NFκB 來(lái)影響相關(guān)炎癥因子（TNFα和IL-6 等）表達(dá)量的變化，進(jìn)而影響妊娠。在牛體外研究上的結(jié)果表明，牛子宮內(nèi)膜釋放的外泌體可以增加體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移囊胚的形成率和孵化率[37]，并且子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞在低氧應(yīng)激下能促進(jìn)外泌體的釋放[38]。以上表明，外在刺激可以影響外泌體的釋放，并且外泌體在牛妊娠過(guò)程中與免疫調(diào)控、胚胎發(fā)育相關(guān)。

2.4 外泌體對(duì)羊妊娠的影響 在羊上，已有研究將羊作為模型用于與外泌體相關(guān)的體內(nèi)試驗(yàn)。Burns 等[39-40]發(fā)現(xiàn)，羊子宮分泌的外泌體可以在體內(nèi)被胚胎和子宮內(nèi)膜吸收；同時(shí)在體外也可以被子宮內(nèi)膜細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞吸收，并對(duì)妊娠14 d 和正常月經(jīng)第14 天的羊子宮腔液細(xì)胞外囊泡mRNA、miRNA 和蛋白組測(cè)序來(lái)分析早期妊娠中mRNA、miRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化。這些研究表明外泌體可以在胚胎-母體交流過(guò)程中傳遞mRNA、miRNA 和蛋白組等生物信息。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)孕激素處理后可以提高子宮腔液中外泌體的釋放量，將孕激素處理后的子宮腔液外泌體做一個(gè)miRNA 測(cè)序，來(lái)研究孕激素對(duì)外泌體成分的影響[41]。Duckett 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，在羊妊娠中期血清中外泌體活力（用乙酰膽堿酯酶含量代表）會(huì)保持穩(wěn)定，但是在妊娠第133 天會(huì)降低。因此，外泌體的釋放可以受到孕激素的調(diào)控，并且血清中外泌體的含量在妊娠期間會(huì)發(fā)生變化。

在羊上，也發(fā)現(xiàn)外泌體與胚胎的發(fā)育相關(guān)。Cleys等[43]對(duì)血清、臍血清和胎盤外泌體樣本提取miRNA 進(jìn)行測(cè)序，通路分析發(fā)現(xiàn)血清外泌體miRNA 靶向細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖以及器官發(fā)育通路；同時(shí)，臍血清和胎盤外泌體miRNA 靶向細(xì)胞、生物和胚胎發(fā)育信號(hào)通路。

值得關(guān)注的是，子宮內(nèi)膜釋放包含內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的外泌體，可以通過(guò)TLR 介導(dǎo)進(jìn)而影響孕體IFNT的分泌，這是反芻動(dòng)物妊娠識(shí)別的信號(hào)；同時(shí)外泌體影響滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的增殖[8]。這表明外泌體與早期妊娠識(shí)別信號(hào)相關(guān)。

2.5 外泌體對(duì)豬妊娠的影響 在豬上，已經(jīng)有研究分離出豬子宮腔液中的細(xì)胞外囊泡并分析其中miRNA 表達(dá)量的變化。Krawczynski 等[44]發(fā)現(xiàn)子宮腔液中細(xì)胞外囊泡中miR-125b 在妊娠14 d 和16 d 差異表達(dá)，并且miR-125b 在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中可以調(diào)控能影響胚胎發(fā)育和附植的重要基因的表達(dá)；Bidarimath 等[9]在豬母胎界面觀察到細(xì)胞外囊泡的存在，然后提取豬胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)液外泌體進(jìn)行蛋白測(cè)序分析，并且觀察到2 類細(xì)胞可以吸收另一方釋放的外泌體。研究結(jié)果可以說(shuō)明，在豬妊娠早期，外泌體可以攜帶miRNA 和蛋白質(zhì)來(lái)介導(dǎo)胚胎-母體的信息交流。

在體外實(shí)驗(yàn)上，Bai 等[45]使用精液外泌體處理豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，通過(guò)mRNA 測(cè)序，發(fā)現(xiàn)豬精液外泌體會(huì)誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞免疫相關(guān)基因mRNA 水平的表達(dá)；Saadeldin 等[46]發(fā)現(xiàn)孤雌胚胎培養(yǎng)液的外泌體處理克隆胚胎會(huì)提高其發(fā)育能力。以上研究結(jié)果說(shuō)明，精液外泌體可以影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞，胚胎之間也可能通過(guò)外泌體進(jìn)行信息傳導(dǎo)。

3 結(jié) 語(yǔ)

在近十幾年里，外泌體領(lǐng)域研究正在快速發(fā)展并在不斷探索其在生理上和病理上的功能。外泌體在妊娠過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，在子宮內(nèi)，來(lái)源于胚胎、胎盤和母體子宮內(nèi)膜的外泌體可以通過(guò)傳遞蛋白質(zhì)、mRNA、非編碼RNA 等生物學(xué)信息給受體細(xì)胞進(jìn)而影響妊娠。外泌體是一種胚胎和母體環(huán)境之間的直接和動(dòng)態(tài)交流方式，它們可以釋放外泌體并能吸收另一方釋放的外泌體。但是，哪類外泌體在妊娠過(guò)程中發(fā)揮“主效作用”及其在子宮內(nèi)精確靶向機(jī)制依然有待研究。

外泌體在妊娠識(shí)別、胚胎附植、免疫調(diào)控、胚胎發(fā)育、分娩等過(guò)程中都發(fā)揮了重要的作用。在妊娠識(shí)別過(guò)程中，外泌體與早期妊娠識(shí)別信號(hào)相關(guān)，并且血清中胎盤外泌體的含量在妊娠過(guò)程中會(huì)發(fā)生變化。然而，是否可以通過(guò)精確定量檢測(cè)外泌體及其內(nèi)容物含量對(duì)家畜的早期妊娠進(jìn)行判斷并運(yùn)用到生產(chǎn)實(shí)踐中，依然有待研究。在胚胎附植過(guò)程中，子宮內(nèi)膜以及體外培養(yǎng)的胚胎都可釋放外泌體來(lái)促進(jìn)胚胎黏附，進(jìn)而來(lái)影響胚胎附植。就免疫調(diào)控而言，胎盤外泌體可以通過(guò)激活NFκB 通路來(lái)影響母體炎癥因子的表達(dá)量，并且可以調(diào)控母體免疫細(xì)胞和促進(jìn)免疫耐受。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，子宮內(nèi)膜、孤雌胚胎和胎盤可以釋放外泌體來(lái)刺激體外胚胎的發(fā)育，并且外泌體可以作為小鼠胚胎的有效藥物載體；外泌體在未來(lái)有望成為其他大型哺乳動(dòng)物胚胎的藥物或者其他貨物的載體進(jìn)而對(duì)胚胎進(jìn)行靶向給藥以及靶向補(bǔ)給。就分娩而言，外泌體可以作為分娩的旁分泌的介質(zhì)進(jìn)而來(lái)誘導(dǎo)分娩?？偠灾?，外泌體對(duì)哺乳動(dòng)物妊娠過(guò)程有著重要影響，進(jìn)一步的研究可以更好地明確不同來(lái)源的外泌體在妊娠過(guò)程中的作用機(jī)理。